Per iniziare, prendi i campioni fecali umani preparati. Raffreddare la centrifuga refrigerata ad alta velocità a 4 gradi Celsius. Utilizzare PBS per regolare il peso delle provette a 0,1 grammi e centrifugarle a 3.000 g per 20 minuti a 4 gradi Celsius.
Utilizzando una pipetta di plastica, trasferire il surnatante in due provette da 50 millilitri, lasciando 1 millilitro. Quindi, centrifugare il surnatante a 12.000 G per 30 minuti a 4 gradi Celsius. Utilizzando una siringa da 20 millilitri, aspirare il surnatante e rimuovere l'ago dalla siringa.
Filtrare il liquido attraverso filtri da 0,22 micrometri in tubi da 50 millilitri. Quindi, pulisci il secchio con alcol al 75% per eliminare eventuali contaminazioni residue. Trasferire circa 30 millilitri di surnatante fecale filtrato nella provetta dell'ultracentrifuga.
Riempi il tubo con circa 8 millilitri di PBS, lasciando uno spazio di 3 millimetri dall'apertura del tubo. Posizionare le due provette per ultracentrifuga in secchi di ultracentrifugazione opposti ed equalizzare il peso dei due secchi utilizzando PBS. Caricare tutte le benne sul rotore, indipendentemente dal fatto che siano caricate con tubi.
Mettere i campioni nella centrifuga, avviare il vuoto e farli girare a 160.000 G per 70 minuti a 4 gradi Celsius. Al termine della centrifugazione, rilasciare il vuoto della camera e aprire lo sportello dell'ultracentrifuga. Quindi, rimuovere prontamente il rotore.
Trasferire i secchi dal rotore alla rastrelliera e prelevare i tubi utilizzando una pinza. Scartare il surnatante e conservare i pellet marroni visibili. Aggiungere 1 millilitro di PBS pre-raffreddato per risospendere completamente il pellet.
Riempi il tubo con circa 37 millilitri di PBS, lasciando uno spazio di 3 millimetri dall'apertura. Dopo aver eseguito un altro ciclo di ultracentrifugazione, scartare il surnatante e lasciare la provetta capovolta per 5 minuti. Rimuovere eventuali residui di soluzione sulla parete interna con dei tergicristalli.
Utilizzando una pipetta da 1.000 microlitri, aggiungere 1,2 millilitri di PBS pre-raffreddato per risospendere i pellet e mescolarli mediante pipettaggio. Trasferire 1,2 millilitri della soluzione PBS BEV da una provetta per ultracentrifuga a una microprovetta pulita da 1,5 millilitri.
