Per iniziare, spruzza il topo soppresso con alcol al 75%. Quindi hai sterilizzato le forbici da dissezione per aprire la pelle ed esporre la cavità toracica. Tagliare il diaframma, quindi continuare a tagliare verso l'alto verso la mascella inferiore e rimuovere con cautela i tessuti connettivi e il grasso in eccesso esponendo l'arteria carotide.
Successivamente, taglia la vena cava inferiore per far defluire il sangue dalla circolazione chiusa. Usando una siringa, iniettare lentamente 20 millilitri di soluzione di perfusione pre-raffreddata nel ventricolo sinistro. Metti il topo sotto un microscopio stereoscopico.
Quindi, usando le forbici da microdissezione, stacca il grasso e i tessuti connettivi intorno all'arteria carotide. Isolare l'arteria carotide e lavarla con PBS per eliminare eventuali residui di sangue. Trasferire l'arteria in una piastra a sei pozzetti contenente l'1,5% di FBS su ghiaccio.
Usando le forbici da microdissezione, sezionare longitudinalmente l'arteria carotide e posizionarla in una nuova piastra a sei pozzetti contenente un millilitro di FBS su ghiaccio. Sciacquare accuratamente l'intima dell'arteria con FBS per rimuovere il sangue residuo. Tagliare l'arteria in pezzi di tessuto quadrati di due millimetri e trasferirli in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri.
Centrifugare a 400 g per 5 minuti a 4 gradi Celsius per far affondare i tessuti sul fondo. Scartare il surnatante e risospendere i tessuti in 500 microlitri di reagente di dissociazione A.Mettere la provetta in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per un'ora, pipettando delicatamente con una pipetta da un millilitro ogni 10 minuti. Quindi aggiungere 500 microlitri di FBS al 5% nel tubo e mescolare bene.
Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino sterile da 40 micron in una provetta da 1,5 millilitri. Quindi centrifugare il filtrato e rimuovere il surnatante prima di risospendere il pellet in 200 microlitri di reagente di dissociazione B.Posizionare la provetta in un bagno d'acqua per dissociare completamente le cellule in una sospensione a singola cellula. Dopo cinque minuti, aggiungere 200 microlitri di FBS al 5% per terminare la reazione di digestione, centrifugare la sospensione e scartare il surnatante prima di risospendere il pellet in 100 microlitri di PBS su ghiaccio.
Le osservazioni microscopiche hanno mostrato che la combinazione del reagente di dissociazione B con il reagente A ha portato a una dissociazione più completa del tessuto carotideo rispetto all'utilizzo del solo reagente di dissociazione A. Un totale di 176.000 singole cellule sono state raccolte da nove carotidi sinistre, con la maggior parte dei vasi vascolari che sono stati dissociati con successo in singole cellule ad alta vitalità. Dopo la digestione, il clustering basato su SIRAH non supervisionato ha rivelato quattro tipi principali di cellule nelle arterie carotidi di topo normali.
