Per iniziare, mantenere la sterilità pulendo guanti, cartucce e piastre di coltura con etanolo al 70%. Quindi, accendere il compressore per la biostampante e selezionare il pulsante inizializzato per inizializzare la stampante. Pulire le superfici all'interno della stampante con etanolo al 70%.
Utilizzando il pulsante Esecuzione di stampa, caricare il file di stampa e aprire il PDF del protocollo di stampa. Scongelare bioink, fluidi attivatori e 50 millilitri di terreno completo a temperatura ambiente. Preparare la cartuccia di stampa come indicato nel PDF del protocollo di stampa, assicurandosi che i volumi corretti di reagenti siano disponibili negli scomparti specificati.
Quindi, aggiungi 1,2 millilitri di F3 a C1, 1,2 millilitri di F32 a C2 e 200 microlitri di F261 a C4. Rimuovere la piastra rivestita di polietilenimmina e laminina dall'incubatrice. Posizionare lo scomparto portatarga su una piastra a basso profilo. Inserire la lastra nello scomparto destro del supporto della stampante.
Rimuovere il coperchio dalla piastra e posizionarlo nel supporto del coperchio. Inserire la cartuccia di stampa nella biostampante e selezionare il pulsante Print Inert Base per avviare la tiratura. Dopo lo scongelamento, centrifugare i neuroni glutammatergici e gli astrociti, aspirare il surnatante e risospendere entrambi i tipi di cellule separatamente in un millilitro di terreno completo.
Mescolare 20 microlitri di sospensione cellulare con lo stesso volume di blu di tripano e contare le cellule per determinare la concentrazione cellulare vitale per ciascun tipo di cellula. Successivamente, combina 3 milioni di neuroni glutammatergici con 1 milione di astrociti in una provetta da 15 millilitri e aggiungi terreni completi per ottenere un volume finale di otto millilitri. Centrifugare la sospensione cellulare e aspirare il surnatante senza disturbare il pellet.
Sospendere il pellet in 200 microlitri di fluido attivatore F299 pipettando su e giù. Posizionare i coperchi sulla cartuccia e sulla piastra di coltura e rimuoverli dalla biostampante. In un armadio di biosicurezza, aggiungere 200 microlitri di sospensione cellulare al pozzetto C3 della cartuccia di stampa.
Reinserire la cartuccia nella biostampante e rimuovere il coperchio come mostrato in precedenza. Avviare la fase dei modelli di stampa della tiratura. Contemporaneamente, sostituire il supporto laminato dalla piastra di controllo 2D con un supporto completo.
Inserire la piastra di targeting per bioprinting nella biostampante e rimuovere il coperchio. Inizia il processo di targeting della biostampa. Quando richiesto, rimuovere la piastra di puntamento dalla biostampante.
Utilizzare la guida per identificare i punti in cui è possibile osservare le goccioline sulla piastra. Reinserire la piastra di puntamento nella biostampante per ripetere il processo di stampa e selezione delle gocce. Quando richiesto, sostituire la piastra di puntamento con una piastra per coltura cellulare.
Dopo la stampa, aggiungere il terreno completo a tutti i pozzetti di co-coltura 3D e incubare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Infine, smaltire le cartucce e i liquidi rimanenti. secondo i protocolli di laboratorio.
Dopo sette giorni di stampa, non rimaneva quasi nessuna singola cellula e fasci interconnessi di neuriti e proiezioni astrocitarie apparivano fortificati. La crescita dei neuriti è aumentata linearmente tra le 12 e le 156 ore. Durante la crescita dei neuriti, anche gli ammassi di corpi cellulari sono aumentati di dimensioni.
L'analisi della vitalità cellulare ha mostrato che circa il 72% delle cellule totali era vivo il quarto giorno, mentre il 29% era morto. L'immunocolorazione ha confermato la morfologia cellulare sana dei neuroni e degli astrociti biostampati, con entrambi i tipi di cellule che mostrano una crescita di protrusioni cellulari. Il fenotipo glutammatergico dei neuroni è stato confermato attraverso l'immunocolorazione per il recettore 2 del glutammato.
