Inizia attaccando un separatore magnetico al suo supporto. Collegare una colonna di selezione al separatore magnetico e posizionare un filtro cellulare da 70 micron sopra la colonna di selezione. Posizionare una provetta da 50 millilitri sotto la colonna di selezione per raccogliere il flusso.
Una volta che le cellule cerebrali di topo raggiungono l'80% di confluenza, aspirare il terreno e sciacquare le cellule con PBS. Aggiungere lo 0,25% di tripsina per staccare le cellule di aderenza e incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Aggiungere quindi un buffer di arresto.
Centrifugare la sospensione cellulare a 300 G per cinque minuti e rimuovere il surnatante. Per la colorazione degli anticorpi, risospendere 10 delle sette cellule in 100 microlitri di PBS. Quindi aggiungere 10 microlitri di soluzione anticorpale LYVE-1 e mescolare accuratamente.
Incubare la miscela per 30 minuti al buio a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione, centrifugare le cellule ed eliminare il surnatante. Quindi sciacquare le cellule aggiungendo un millilitro di PBS e centrifugare a 300 G per cinque minuti.
Per l'etichettatura delle microsfere, risospendere il pellet in 100 microlitri di PBS e 20 microlitri di microsfere. Gonfia e incuba per 30 minuti al buio a quattro gradi Celsius. Quindi centrifugare la sospensione e lavare il pellet con un millilitro di PBS.
Anche in questo caso, centrifugare e risospendere il pellet in quattro millilitri di PBS per l'esclusione magnetica negativa. Passare la sospensione cellulare attraverso un colino da 70 micron per eliminare i grumi. Preparare la colonna di selezione sciacquandola con tre millilitri di PBS.
Quindi aggiungere la sospensione delle celle nella colonna di selezione. Lavare la colonna con tre millilitri di PBS e raccogliere le cellule negative LYVE-1 in una provetta da 50 millilitri. Per la selezione magnetica positiva, pipettare sei millilitri di PBS nella colonna di selezione.
Quindi lavare le celle marcate magneticamente spingendo con decisione lo stantuffo nella colonna di selezione per ottenere LLEC positivi LYVE-1. Successivamente, centrifugare la sospensione di cellule positive e rimuovere il surnatante. Piastra da 10 a cinque cellule per centimetro quadrato in un matraccio T25 con cinque millilitri di terreno di coltura.
Mantenere la cultura sostituendo il 50% del terreno a giorni alterni. Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, staccarle come dimostrato in precedenza prima di eseguire il passaggio cellulare. L'analisi della citometria a flusso ha rivelato che la percentuale di cellule positive a LYVE-1 nel passaggio due non era significativamente diversa dal passaggio tre dopo MACS, indicando una purezza superiore al 95%La colorazione immunofluorescente ha confermato la co-colorazione di LYVE-1 con PDPN, VEGFR-3 e PROX1, stabilendo l'identità delle LLEC.
Le cellule positive a LYVE-1 non esprimevano F48 e il fattore di crescita beta derivato dalle piastrine, distinguendo efficacemente le LLEC dai macrofagi e dai fibroblasti. Le cellule leptomeningee prima della MACS mostravano una morfologia eterogenea che andava dalle sfere rotonde alle forme delle fibre fuse. Tuttavia, dopo la MACS, gli LLEC hanno mostrato caratteristiche tipiche simili a quelle endoteliali, come la forma a fuso e a ciottoli.
