Per iniziare, incubare le uova di gallina fecondate in un'incubatrice umidificata a 38 gradi Celsius. Ora sezionare le pelli dorsali dell'embrione di pollo allo stadio da 30 a 33 in HBSS. Quindi incubare le bucce in soluzione salina priva di calcio e magnesio due volte con EDTA allo 0,25% per 15-20 minuti.
Separare con cura l'epitelio e il MESENCHIMA utilizzando una pinza da orologiaio e spostare il materiale separato in HBSS, posizionato su ghiaccio. Raccogliere il mesenchima separato in una provetta da centrifuga da 15 millilitri e aggiungere due millilitri di collagenasi tripsina allo 0,1% prodotta in PBS. Quindi incubare la soluzione a bagnomaria.
Quindi, utilizzare una pipetta Pasteur per disperdere il mesenchima cutaneo in una sospensione a singola cellula. Quindi aggiungere otto millilitri di DMEM contenente il 10% di siero fetale bovino per fermare la digestione. Centrifugare le celle a 233G per cinque minuti.
Quindi risospendere il pellet nel terreno di coltura. Quindi posizionare un inserto di coltura cellulare in un pozzetto di un piatto a sei pozzetti, far cadere una gocciolina da 10 microlitri di cellule mesenchimali sull'inserto. Nel pozzetto esterno dell'inserto, pipettare due millilitri di DMEM con il 10% di siero fetale bovino.
Incubare le cellule piastrate a 37 gradi in un incubatore con il 5% di anidride carbonica e il 95% di aria per un'ora. Utilizzando una pipetta da un millilitro, trasferire l'epitelio intatto sopra la gocciolina mesenchimale placcata. Appiattire l'epitelio intatto sul mesenchima per formare l'espiante cutaneo ricostituito.
Lasciare un sottile strato di terreno sull'inserto per mantenere l'espiante della pelle semi umido. Fornendo un'interfaccia aria/liquido, incubare l'espiante di pelle ricostituita a 37 gradi in un incubatore con il 5% di anidride carbonica e il 95% di aria. Le colture di organi ex vivo appaiono omogenee all'inizio: gemme di piume corte si formano dopo due o tre giorni di coltura e gemme di piume lunghe si formano dopo quattro o cinque giorni di coltura.
