Iniziare la diluizione del campione di siero umano mescolando cinque microlitri del campione di siero con 120 microlitri di tampone del saggio in una piastra da 96 pozzetti. Diluire fino a otto volte mescolando 10 microlitri della diluizione iniziale con 70 microlitri di tampone del saggio. Ora, prepara 100 microlitri della miscela di microsfere contenente perline accoppiate all'antigene target.
Successivamente, diluire la miscela di microsfere preparata in 2,4 millilitri di tampone del saggio in una provetta Falcon. Iniziare l'incubazione del siero pipettando 25 microlitri della sospensione di microsfere in appositi pozzetti. Aggiungere 25 microlitri di siero diluito 200 volte nei pozzetti con la sospensione di perline.
Coprire la piastra di reazione a 96 pozzetti con un sigillo per micropiastre. Quindi incubare la piastra con le perline su uno shaker per piastre. Dopo l'incubazione, rimuovere la piastra di reazione a 96 pozzetti dall'agitatore per piastre.
Posizionare la piastra in una rondella magnetica per piastre e rimuovere il sigillo adesivo della piastra. Successivamente, lavare le perline tre volte con 100 microlitri di tampone di lavaggio, quindi aspirare il volume di lavaggio finale dalle perline dopo l'ultima fase di lavaggio. Per la prima incubazione degli anticorpi, iniziare preparando una nuova miscela di reagenti a doppia rilevazione IgG e IgM nel tampone del saggio.
Pipettare 30 microlitri del reagente di rilevamento in ciascun pozzetto designato, quindi coprire la piastra di reazione a 96 pozzetti con un sigillo per micropiastra. Incubare la piastra su uno shaker per 45 minuti a 20 gradi Celsius a 750 giri al minuto. Dopo l'incubazione, posizionare la piastra in una rondella magnetica per piastre e rimuovere la pipetta di sigillo della piastra adesiva 30 microlitri di striptavidina diluita marcata BV421 in ogni reazione dopo aver lavato le piastre come prima.
Quindi posizionare la piastra sigillata su uno shaker per la successiva incubazione. Una volta completata l'incubazione, lavare la piastra e risospendere le perle all'interno dei pozzetti fino a un volume finale di 100 microlitri utilizzando il tampone di lavaggio. Per analizzare i risultati, coprire la piastra di reazione a 96 pozzetti con un sigillo per micropiastre.
Successivamente, incubare la piastra coperta per tre minuti a 20 gradi Celsius a 1000 giri al minuto su uno shaker per piastre. Trasferire la piastra dall'agitatore allo strumento dell'analizzatore di flusso a doppio reporter. Infine, valutare l'intensità fluorescente mediana del campione, o MFI, seguendo le istruzioni del produttore.
L'analisi di correlazione di Spearman per tre antigeni rappresentativi di Borrelia ha dimostrato una riproducibilità uniforme dei valori di MFI nel rilevamento di anticorpi anti-Borrelia presenti nei sieri umani. Il test a doppio reporter ha mostrato una buona riproducibilità da saggio a saggio con un'elevata precisione tra i saggi dimostrata dai grafici di Levey-Jennings. A diluizioni del campione da 100 a 12, 800 volte, le curve di diluizione sia per la rilevazione delle IgM che per la rilevazione delle IgG erano simili per entrambi gli strumenti.
I valori dell'IFM erano leggermente più alti nello strumento reporter singolo.
