Per eseguire SPR per le interazioni VHL-MZ1, attivare prima il chip streptavidina secondo le istruzioni del produttore Per ottenere la massima concentrazione, aggiungere un tampone privo di DMSO all'MZ1 per garantire una concentrazione di DMSO del 2%. Ora pipettare 50 microlitri della soluzione a più alta concentrazione in un pozzetto contenente 100 microlitri del tampone in esecuzione. Mescolare accuratamente per ottenere la seconda concentrazione più alta.
Quindi, trasferire 50 microlitri della soluzione ai successivi 100 microlitri di tampone corrente, mescolare bene per preparare la terza concentrazione più alta e così via. Utilizzare fogli di plastica trasparente autoadesivi compatibili con micropiastre in polipropilene per coprire la piastra. Avviare l'SPR utilizzando l'impostazione multiciclo.
Impostare la modalità ad alte prestazioni, il tempo di contatto a 120 secondi, il tempo di dissociazione a 300 secondi e la portata a 50 microlitri al minuto. Utilizzare il software di valutazione fornito dal produttore dello strumento per eseguire l'analisi dei dati. Per eseguire SPR per il complesso ternario VHL-MZ1-BRD4, attivare prima la streptavidina.
Iniettare la soluzione VHL per immobilizzarla a circa 100 unità di risonanza. Per il controllo negativo utilizzando solo BRD4, preparare la concentrazione più alta di 25 micromolari nel tampone corrente con un volume di 200 microlitri. Ai quattro pozzetti successivi, aggiungere 160 microlitri ciascuno di BRD4 a due micromolari.
Trasferire 40 microlitri dal pozzetto A5 all'A4. Quindi, pipetta il pozzetto per mescolare accuratamente. Allo stesso modo, trasferire 40 microlitri dal pozzo A4 all'A3, continuando questo processo fino a raggiungere A1. Per la formazione di complessi ternari con MZ1 e BRD4, pipettare 196 microlitri di soluzione BRD4 a 25,5 micromolari. A questo, aggiungere quattro microlitri di MZ1 a 20 micromolari preparato in soluzione 100% DMSO.
Pipettare 160 microlitri di BRD4 a due micromoli nel tampone in esecuzione nei quattro pozzetti successivi a sinistra. Quindi trasferire 40 microlitri dal pozzetto B5 a B4 e pipettare per mescolare accuratamente. Continuare a trasferire la soluzione da ciascun pozzetto fino a B1. Ora esegui l'SPR alla configurazione a ciclo singolo con un tempo di contatto di 100 secondi, un tempo di dissociazione di 720 secondi e una portata di 50 microlitri al minuto.
E' stata eseguita la caratterizzazione del complesso binario VHL-MZ1 e del complesso ternario VHL-MZ1-BRD4. È stata osservata una cooperazione positiva. La caratterizzazione del sistema cereblon, PROTAC e PPM1D è stata eseguita da SPR.
Gli esperimenti PPM1D utilizzano un chip NTA di nichel e la superficie del chip viene rigenerata dopo ogni iniezione di composto. BRD-2512, che si lega solo al cereblon, e BRD-4761, che si lega solo a PPM1D, mostrano una risposta di legame trascurabile. BRD-5110 induce la formazione di un complesso ternario tra PPM1D e mostra un effetto gancio ad alte concentrazioni di composti.
