Per iniziare, preparare un terreno di coltura organoide contenente 10 micromolari Y-27632 e 2,5 micromolari CHIR-99021. Dopo aver rivestito l'ECM sul gut-on-a-chip, scollegare il tubo di uscita dal microcanale superiore mantenendo aperto il tubo di bypass del microcanale superiore. Utilizzando una clip per legante, fissare sia l'ingresso che l'uscita del microcanale inferiore.
Utilizzando una micropipetta P100, aggiungere 20 microlitri di sospensione cellulare nel foro di uscita del microcanale superiore. Fissare il bypass e il tubo di ingresso del microcanale superiore utilizzando clip di legatura. Ricollegare il tubo di uscita al foro di uscita del microcanale superiore, assicurandosi che il tubo rimanga aperto durante tutto il processo.
Una volta terminato, fissare gradualmente il tubo di uscita del microcanale superiore utilizzando una clip per legante. Successivamente, al microscopio, verificare che le cellule siano distribuite uniformemente in tutto il microcanale superiore. Posizionare il dispositivo gut-on-a-chip e un'incubatrice di anidride carbonica umidificata a 37 gradi Celsius.
Collegare la siringa attaccata al microcanale superiore del chip a una pompa a siringa posta all'interno di un'incubatrice. Impostare la portata a 30 microlitri all'ora e avviare il flusso continuo del fluido di seduta per il microcanale superiore. Durante questo periodo, lasciare il microcanale inferiore clamped.
Il giorno dopo l'insediamento, sostituire il terreno con un terreno di coltura organoide contenente solo A-83-01. Una volta stabilito il monostrato per il microcanale superiore, avviare il flusso continuo del fluido di alloggiamento verso il microcanale inferiore. Successivamente, introdurre il terreno di coltura organoide nei microcanali superiore e inferiore per avviare lo sviluppo della morfogenesi tridimensionale nel chip.
Aumenta la portata a 50 microlitri all'ora per ottenere uno stress puro di 0,02 dine per centimetro quadrato nel design gut-on-a-chip. Utilizzando un bioreattore regolato da computer, applicare una deformazione ciclica del 10% e una frequenza di 0,15 hertz alle cellule coltivate su un dispositivo gut-on-a-chip per due o tre giorni per stabilire la morfogenesi tridimensionale. Dopo sei-nove giorni di flusso medio, è stato osservato un raggruppamento occasionale della morfogenesi tridimensionale delle cellule epiteliali intestinali canine in tutto il microcanale.
La colorazione immunofluorescente ha valutato la struttura tridimensionale dei monostrati derivati da organoidi e delle strutture simili ai villi nei chip microfluidici. La funzione di barriera intestinale misurata mediante TEER ha mostrato valori stabili di TEER il quinto giorno di coltura.
