Inizia coltivando i campioni di occhielli isolati da topi con dieta grassa normale o dieta ad alto contenuto di grassi durante la notte a 37 gradi Celsius. Progettare le condizioni sperimentali desiderate per lo studio. Per ogni condizione sperimentale, utilizzando una pipetta, prelevare 100 occhielli in una capsula di Petri di sei centimetri contenente due millilitri di terreno oculare.
Per indurre la mitofagia, trattare gli occhielli nelle apposite piastre di Petri con due microlitri di 250 nano molari di valinomicina per tre ore. Isolare gli occhielli e, utilizzando una pipetta, trasferire gli occhielli da ciascuna capsula di Petri in una provetta da microcentrifuga separata. Quindi, ruotare gli occhielli a 350 G per un minuto a 10 gradi Celsius e, utilizzando una pipetta, scartare il surnatante.
Lavare due volte il campione ottenuto con un millilitro di PBS. Tra un lavaggio e l'altro, centrifugare il campione ed eliminare il surnatante come dimostrato in precedenza. Per dissociare gli occhielli in singole cellule, aggiungere 500 microlitri di tripsina allo 0,05% preriscaldata a 37 gradi Celsius, in una provetta del campione.
Pipettare ripetutamente il contenuto della provetta su e giù fino a quando gli occhielli non sono visibilmente dispersi. Aggiungere immediatamente un millilitro di terreno oculare preriscaldato per neutralizzare la tripsina. Centrifugare i campioni a 500 G per cinque minuti a 10 gradi Celsius.
Rimuovere il surnatante con cautela senza disturbare il pellet. Quindi, lavare i campioni due volte con un mezzo a flusso ad occhiello. I campioni di cellule sono ora pronti per essere colorati per l'analisi citofluorimetrica della mitofagia delle cellule beta.
