Procedere all'esecuzione dell'analisi citofluorimetrica della mitofagia delle cellule beta, con una singola sospensione cellulare di circa 100 isole specchianti isolate preparate, corrispondenti ad ogni condizione sperimentale desiderata da studiare. Innanzitutto, risospendere i campioni di isole per ciascuna condizione in 500 microlitri di mezzo di flusso dell'isolotto. Aggiungere 0,25 microlitri di MtPhagy alle provette designate per ricevere il colorante MtPhagy.
Allo stesso modo, aggiungere 0.25 microlitri di brodo TMRE e fluozin-3-AM ai rispettivi tubi designati. Avvolgere i tubi in un foglio di alluminio e vorticare ogni tubo a bassa velocità per cinque secondi per mescolare il contenuto. Quindi incubare le provette a 37 gradi Celsius per 30 minuti.
A metà dell'incubazione, far vorticare ogni campione a bassa velocità per 5-10 secondi. Dopo l'incubazione, centrifugare le provette a 350 G per un minuto a 10 gradi Celsius. Scartare il surnatante.
E risospendere i campioni in 500 microlitri di mezzo di flusso dell'isolotto. Aggiungere DAPI alle provette per microcentrifuga contenenti campioni che richiedono il trattamento DAPI. Centrifugare di nuovo ed eliminare il surnatante come dimostrato in precedenza.
Risospendere il residuo in 500 microlitri di mezzo di flusso dell'isolotto. Infine, posizionare i campioni su ghiaccio e quindi procedere con la citometria a flusso. Regolare le tensioni per la dispersione diretta o FSC e la dispersione laterale o SSC per garantire che le popolazioni di cellule siano al centro del grafico a dispersione.
Per escludere i multipletti, in corrispondenza di un gate rettangolare in corrispondenza dell'altezza FSC rispetto alla larghezza FSC, seguito dall'altezza SSC rispetto alla larghezza SSC. Regolare le tensioni e la compensazione per DAPI per filtrare le cellule beta vive. Impostare i cancelli di fluorescenza per ciascun fluoroforo utilizzato in base al campione RFD non colorato.
Una volta stabiliti i gate, raccogliere 10.000 eventi per campione. Le cellule beta con un elevato utilizzo della mitofagia sono state definite come la fluozin alta, la mtfagia alta TMRE, la bassa popolazione nel quadrante tre o Q3. I livelli basali e di mitofagia indotta da valinomicina sono stati caratterizzati sia nelle isole RFD che HFD.
