Per valutare la mitofagia nelle cellule beta pancreatiche murine utilizzando il reporter mitofagico geneticamente codificato, colture di isole pancreatiche isolate da topi wild type e Mt-Keima durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno seguente, aggiungere 100 isolotti in una capsula di Petri di sei centimetri contenente due millilitri di terreno per ogni condizione sperimentale utilizzata in questo protocollo. Successivamente, dissociare gli occhielli in singole cellule e colorare con FluoZin-3-AM e DAPI come dimostrato in precedenza per l'approccio basato sul colorante Mt-Fagia.
Procedere quindi con l'analisi citofluorimetrica dei campioni. Regolare le tensioni di dispersione diretta o FSC e di dispersione laterale o SSC per ottenere una distribuzione uniforme delle celle su un grafico SSCA rispetto a FSCA. Per selezionare celle singole ed escludere multiplette, aggiungere un cancello rettangolare in base all'altezza FSC rispetto alla larghezza FSC, seguito da Altezza SSC rispetto alla larghezza SSE.
I multipletti sono esclusi a causa dei loro valori di segnale di larghezza più elevati. Quindi impostare un gate negativo DAPI per escludere le cellule morte. Successivamente, impostare le porte positive di FluoZin-3-AM per filtrare le cellule beta vive.
Impostare uno schema di gating triangolare utilizzando il campione positivo di Mt-Keima per identificare le popolazioni cellulari acide e neutre. Una volta stabiliti i gate primari e di fluorescenza, valutare il flusso mitofagico utilizzando i cambiamenti basali e indotti dalla valinomicina nella fluorescenza di Mt-Keima.
