Assemblare la barriera emato-encefalica derivata da cellule staminali pluripotenti umane, o iBBB, utilizzando le cellule endoteliali dissociate, i parassiti e gli astrociti, Combinare i tre tipi di cellule in un tubo conico includendo il 10% in più rispetto al numero calcolato di cellule per tenere conto degli errori di pipettaggio. Centrifugare la miscela cellulare a 300 g per tre minuti. Aspirare il surnatante, lasciando il pellet cellulare con circa 50 microlitri di terreno.
Utilizzando una pipetta P200, risospendere delicatamente il pellet cellulare nel terreno residuo per creare un impasto a cellula singola. Posizionare la provetta contenente il liquame cellulare risultante su ghiaccio e aggiungere una quantità sufficiente di GF Basement Membrane Matrix ridotta per il numero desiderato di iBBB. Mescolare le celle in modo omogeneo senza introdurre bolle d'aria.
Pipettare 50 microlitri della miscela di matrice cellulare risultante in un pozzetto di una piastra di coltura con fondo in vetro da 48 o 96 pozzetti e distribuirla uniformemente su tutto il fondo della piastra. Incubare la capsula a 37 gradi Celsius per 30-40 minuti per polimerizzare la matrice incapsulando le cellule. Infine, aggiungere 500 microlitri di terreno astrocitario integrato al pozzetto e mantenere gli iBBB in coltura.
Per una piastra a 96 pozzetti, aggiungere da 100 a 150 microlitri di terreno al pozzetto fino a quando non sono sufficientemente sviluppati per i saggi a valle, che in genere richiedono due settimane. L'iBBB correttamente formato è apparso come un singolo disco traslucido solidificato al microscopio in campo chiaro. Dopo 24 ore, sono state identificate singole cellule uniformemente distribuite.
Dopo due settimane, erano visibili strutture più distinte, anche se difficili da definire.
