Cloning of Solute Carriers (SLCs) into pHTBV1.1 Bacmid for High-Throughput Protein Expression

Per iniziare, aggiungere 150 nanogrammi di trasportatore di soluto, o clone SLC, e 100 nanogrammi del vettore in una piastra a 96 pozzetti. Portare il volume di reazione a 8 microlitri con una soluzione tris 10 millimolari a pH 8. Quindi aggiungere 2 microlitri di miscela di enzimi ricombinanti e incubare per un'ora a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, aggiungere 1 microlitro di proteinasi K e incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Aggiungere 4 microlitri di miscela di reazione a 50 microlitri di cellule E.coli Mach1 chimicamente competenti e trasformare le cellule utilizzando il metodo dello shock termico. Dopo la trasformazione, placcare la sospensione batterica su una piastra di agar LB.

Identificare le colonie che ospitano il vettore pHTBV1.1 con l'inserto del gene SLC utilizzando primer appropriati e protocolli standard per la PCR delle colonie.