Iniziare scongelando i trasportatori di soluti congelati o i pellet di cellule SLC a bagnomaria a temperatura ambiente. Preparare il tampone di solubilizzazione combinando 135 millilitri di tampone base e tre compresse cocktail di inibitori della proteasi. Una volta sciolte le compresse, risospendere il pellet nel tampone di solubilizzazione.
Quindi aggiungere la deaminasi e trasferire la sospensione in un omogeneizzatore raffreddato a ghiaccio. Omogeneizzare la soluzione muovendo lo stantuffo su e giù circa 20 volte, mantenendo l'omogeneizzatore in ghiaccio. Successivamente, aggiungere la soluzione madre di detersivo all'1% di concentrazione finale.
Trasferire la miscela di solubilizzazione in un tubo conico da 50 millilitri e ruotare lentamente a quattro gradi Celsius. Dopo un'ora, centrifugare la miscela e raccogliere il surnatante. Equilibrare un volume di letto da quattro a sei millilitri di resina Strep-Tactin con il tampone di base.
Quindi aggiungere resina equilibrata al surnatante solubilizzato e ruotare per due ore a quattro gradi Celsius. Versare la soluzione su una colonna a flusso gravitazionale e lasciarla fluire. Lavare la resina con 30 volte il volume del letto di Strep Wash Buffer in tre fasi uguali.
Successivamente, aggiungi da tre a cinque millilitri di tampone illusione e incuba per 15 minuti prima di raccogliere l'elute. Misurare la concentrazione proteica mediante spettroscopia UV assorbente. Combina le frazioni di illusione desiderate e aggiungi la proteasi 3C.
Ruotare lentamente il tubo durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, equilibrare da due a quattro millilitri di volume del letto di resina di affinità del metallo cobalto con tampone SEC. Aggiungere la resina di affinità metallica di cobalto equilibrata alla miscela di reazione 3C durante la notte e ruotare a quattro gradi Celsius.
Dopo un'ora, versare la soluzione in una colonna a flusso gravitazionale e raccogliere il flusso. Concentrare il flusso in un filtro centrifugo cutoff da 100 kilodalton ruotando a 3000 g a quattro gradi Celsius. Colonna SEC bilanciata a base di destrano argos con tampone SEC.
Iniettare il campione nel circuito del campione ed eseguire il programma SEC con una portata, in modo tale che la pressione della colonna sia inferiore alle specifiche del produttore della colonna. Utilizzando un raccoglitore di frazioni, raccogliere 300 microlitri di frazioni durante l'intera corsa SEC. Dopo aver raggruppato le frazioni di picco, misurare l'assorbanza a 280 nanometri.
Quindi concentrare i campioni al volume richiesto in un filtro di taglio da 100 kilodalton. L'espressione iniziale della proteina SLC su piccola scala è stata analizzata mediante elettroforesi della pagina SDS. La microscopia a fluorescenza di SLC marcato con GFP ha confermato la localizzazione della proteina, specifica per la membrana plasmatica con significativo accumulo intracellulare.
La proteina chimicamente e strutturalmente omogenea ha prodotto un singolo picco di A280 monodisperso durante la cromatografia ad esclusione dimensionale.
