Per iniziare, iniettare nel topo vettori associati ad AAV nel cervello del topo. Dopo tre o quattro settimane di iniezione del virus, radere le aree ventrali e posteriori del collo di un topo anestetizzato. Pulire le aree rasate utilizzando tre scrub allo iodio a rotazione con soluzione di etanolo al 70%.
Fai un'incisione ventrale nella pelle tra le scapole. Successivamente, posizionare una garza chirurgica sull'incisione e posizionare l'animale in posizione supina, con la testa rivolta verso il chirurgo. Quindi praticare una piccola incisione verticale sul lato destro del collo, sopra la clavicola, per esporre l'arteria carotide destra e la vena giugulare.
Dopo aver separato il tessuto sottocutaneo, esporre la vena giugulare esterna destra e posizionare la sutura sotto la vena. Legare l'estremità distale della vena giugulare per arrestare il flusso sanguigno. Usando micro pinze e forbici, fai una piccola incisione nella vena collassata.
A questo punto, inserire il catetere venoso con lo smusso rivolto verso il basso e spostarlo prossimalmente verso la vena cava superiore fino a raggiungere l'atrio destro. Utilizzando una sutura di seta 7-0, fissare il catetere al vaso. Sezionare i tessuti connettivi per esporre l'arteria carotide comune destra.
Prossimalmente, preposizionare due anelli di sutura di seta 7-0 che rimangono slacciati al livello in cui le arterie carotidi interne ed esterne si dividono. Per interrompere temporaneamente il flusso sanguigno, tirare un'ansa di sutura preposizionata. Quindi, usando delle microforbici o un ago calibro 27, crea una piccola apertura sulla parete del vaso.
Inserire il catetere arterioso prossimalmente mentre si rilascia l'ansa di sutura e far avanzare il catetere per raggiungere l'arcata aortica, senza toccare la valvola aortica. Utilizzare i due punti di sutura preposizionati per fissare il catetere al vaso. Scavare un tunnel sottocutaneo in tutti i cateteri, esternarli nella parte posteriore del collo attraverso l'incisione pretagliata e chiudere l'incisione ventrale.
Unire i cateteri alle porte venose o arteriose del connettore del tubo rivestito in silicone realizzato con un tubo ad ago calibro 25. Dopo aver chiuso l'incisione ventrale, fissare il connettore per via sottocutanea quando la pelle posteriore è sigillata con punti di sutura. Utilizzando fili chirurgici in acciaio inossidabile, riempire i cateteri con soluzione fisiologica eparinizzata e tappare saldamente le estremità dei cateteri.
Per fissare l'animale a un sistema di raccolta del sangue automatizzato 24 ore dopo l'intervento, collegare il gancio di ancoraggio all'anello metallico sulla parte posteriore del collo e collegare la linea arteriosa. Una volta che il catetere arterioso è collegato alla linea di iniezione, collegare i cateteri venosi alle linee di campionamento. Impostare il tempo di iniezione e la dose a 0,5 milligrammi per chilogrammo a 500 microlitri al minuto.
Impostare il tempo e la frequenza del prelievo di sangue, inclusa la diluizione del campione con soluzione fisiologica. Il sistema reintegrerà automaticamente una quantità uguale di soluzione fisiologica per sostituire il sangue campionato. Eseguire la pre-iniezione automatizzata.
Successivamente, eseguire un'iniezione endovenosa automatizzata del farmaco clozapina N-ossido a una velocità di iniezione di 500 microlitri al minuto. Quindi eseguire un prelievo di sangue post-iniezione. Vengono presentati i modelli dell'ormone luteinizzante in femmine adulte di Kiss1-EYFP che hanno ricevuto un'iniezione stereotassica unilaterale di AAV-hM3Dq-mCherry nel nucleo arcuato.
I livelli dell'ormone luteinizzante diestro sono generalmente bassi, ma di solito si osservano variazioni a causa del suo rilascio pulsatile. Un forte aumento dei livelli dell'ormone luteinizzante si verifica in risposta all'iniezione di N-ossido di clozapina. La maggior parte dei neuroni mCherry co-localizzati con Kiss1-EYFP ha dimostrato che l'attivazione virale e neuronale è specifica per la popolazione bersaglio.
Viene mostrato un modello pulsatile di rilascio dell'ormone luteinizzante nei topi wild-type di diestro, seguito dalla risposta ad un'iniezione IP di kisspeptin-10. Sono stati osservati chiari impulsi dell'ormone luteinizzante, tipici per una femmina nel diestro, che mostrano bassi livelli basali di ormone luteinizzante. Un aumento immediato e robusto dell'ormone luteinizzante è stato rilevato in risposta alla somministrazione di kisspeptina.
