Per iniziare, riempi una bomba di vetro con due millilitri di tampone di lisi dei nuclei ghiacciato contenente lo 0,01% di digitonina e aggiungi i pezzi di tessuto cerebrale di topo sezionati. Utilizzando un omogeneizzatore per tessuti Dounce in vetro, omogeneizzare il tessuto 25 volte ciascuno con i pestelli A e B e trasferire l'omogenato risultante in una provetta da 15 millilitri. Aggiungere due millilitri di tampone di lisi dei nuclei ghiacciati contenente lo 0,01% di digitonina all'omogenato e incubare su ghiaccio per cinque minuti.
Quindi, centrifugare i nuclei a 500 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Utilizzando una micropipetta, rimuovere il surnatante e aggiungere quattro millilitri di tampone di lisi dei nuclei ghiacciato contenente lo 0,01% di digitonina. Filtrare la sospensione dei nuclei attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri.
Centrifugare nuovamente i nuclei, rimuovere il surnatante e aggiungere quattro millilitri di tampone colorante per lavare i nuclei. Dopo aver filtrato la sospensione attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri, pellettizzare i nuclei mediante centrifugazione e risospendere i nuclei in un millilitro di PBS contenente lo 0,04% di BSA e inibitori della RNasi. Per contare le cellule, mescolare 10 microlitri di blu di tripano allo 0,4% con 10 microlitri di nuclei in una provetta da 0,5 millilitri.
Conta i nuclei utilizzando un contatore di cellule automatizzato. Trasferire 100 microlitri di nuclei in una provetta FACS per il controllo non colorato. Aggiungere 10 microlitri di 7-AAD ai nuclei rimanenti e incubare per cinque minuti a quattro gradi Celsius e procedere con la selezione dei nuclei utilizzando FACS.
Quindi, trasferire 10 microlitri dei nuclei selezionati in una nuova provetta FACS contenente 90 microlitri di DPBS con FBS inattivato al 2% dal calore. Dopo aver centrifugato i nuclei selezionati, rimuovere il surnatante utilizzando una micropipetta e risospendere i nuclei in 100 microlitri di tampone nuclei diluiti. Prima della cernita, il campione contiene detriti sostanziali con oltre il 99% di singoletti positivi per la colorazione nucleare, indicando un'efficace lisi cellulare.
I nuclei cerebrali dopo la cernita hanno dimostrato un aumento della purezza dall'iniziale 36% a quasi il 100%
