Per iniziare, prendi una fiala contenente le cellule staminali ematopoietiche e progenitrici del midollo osseo di topo. Utilizzando una micropipetta, risospendere il pellet in un millilitro di tampone lisante ACK e incubare per uno o due minuti a temperatura ambiente. Trasferire la miscela risospesa in una provetta da 50 millilitri attraverso il filtro cellulare da 70 micrometri pre-bagnato.
Quindi aggiungere 10 millilitri di tampone FACS per diluire il tampone di lisi ACK. Centrifugare la miscela a 400 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e risospendere il pellet in 10 millilitri di tampone FACS prima risospendendolo in un millilitro di tampone e poi rabboccando con nove millilitri di tampone. Ora, mescola 10 microlitri di blu di tripano allo 0,4% con 10 microlitri di cellule in una provetta da 0,5 millilitri e conta le cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato.
Per colorare le cellule, centrifugare le cellule a 400 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Risospendere il pellet nel tampone FACS per ottenere una concentrazione finale di una volta 10 per le sette cellule per millilitro risospendendo prima il pellet in un millilitro di tampone e poi rabboccando con il volume rimanente. Utilizzando una micropipetta P1000, trasferire la sospensione in una provetta FACS attraverso un tappo di filtro cellulare da 35 micrometri.
Quindi, prepara la miscela colorante come mostrato qui. Dopo la centrifugazione, risospendere la sospensione cellulare in 300 microlitri di colorante, mescolarne una in una provetta e incubare su ghiaccio per 15 minuti al riparo dalla luce. Quindi aggiungere 300 microlitri di miscela due nella provetta del campione e incubare per 20 minuti su ghiaccio al riparo dalla luce.
Aggiungere tre millilitri di tampone FACS alle provette per campioni colorate singole e miste. Ora centrifugare la sospensione cellulare. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet in 500 microlitri del tampone FACS.
Preparare una provetta da 1,5 millilitri preriempita con 500 microlitri di terreno di raccolta. Una volta che lo strumento FACS è stato calibrato, aggiungere 500 microlitri di tampone FACS alla sospensione cellulare e quindi trasferire un millilitro del campione attraverso un tappo di filtro cellulare da 35 micrometri in una nuova provetta FACS. Dopo la selezione delle cellule, trasferire 10 microlitri delle cellule selezionate in una nuova provetta FACS contenente 90 microlitri di tampone FACS.
Pellet la sospensione cellulare per centrifugazione e risospensione in 50 microlitri di PBS con 0,04% di BSA. Trasferire la sospensione in una provetta da 0,2 millilitri e aggiungere 50 microlitri di PBS con BSA alla provetta originale per raccogliere le cellule rimanenti. Trasferire le cellule nella provetta da 0,2 millilitri per raggiungere un volume totale di 100 microlitri.
Eseguire un esperimento pilota per identificare il miglior tempo di lisi per l'isolamento dei nuclei. Dopo aver pellettato i nuclei, risospendere il pellet di nuclei in 12 microlitri di tampone di nuclei diluiti. Aggiungere due microlitri di nuclei a una provetta contenente lo 0,4% di blu di tripano e otto microlitri di PBS con 0,04% di BSA e contare i nuclei utilizzando un contatore di cellule automatizzato.
Dopo aver completato l'isolamento dei nuclei, trasferire sei microlitri di risospensione dei nuclei in una nuova provetta FACS preriempita con 150 microlitri di tampone FACS. Aggiungere tre microlitri di 7-AAD e incubare per cinque minuti con ghiaccio.
