Per preparare i pozzetti di coltura, contrassegnare il coperchio di una piastra da 24 pozzetti con il codice donatore A o B, la data e la dose. Rimuovere le fiale criogeniche contenenti sangue umano dall'azoto liquido e scongelarle parzialmente nel bagno di acqua calda fino a quando non si vedono piccoli cristalli di ghiaccio. Successivamente, in una cappa a flusso laminare, aprire con cautela il flaconcino per evitare che le bolle d'aria fuoriescano all'interno del tubo.
Risospendere e trasferire il contenuto del flaconcino in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Facendo roteare delicatamente il tubo, goccia a goccia, aggiungere un millilitro di PBS preriscaldato. Utilizzare una pipetta P-1000 per miscelare PBS e sangue.
Per una diluizione e un lavaggio uniforme, aggiungere sette millilitri di PBS preriscaldato alla provetta da 15 millilitri e mescolare mediante pipettaggio. Centrifugare il sangue a 180 g per otto minuti. Nel frattempo, riempire i pozzetti non marcati di una piastra da 24 pozzetti con 500 microlitri di PBS e preriscaldare la piastra a 37 gradi Celsius.
Dopo la centrifugazione, rimuovere con cautela il surnatante, lasciando circa un millilitro nella provetta senza disturbare la tavolozza. Usando una pipetta, risospendere la tavolozza nel surnatante rimanente. Quindi aggiungere gradualmente otto millilitri di PBS caldo nel tubo come dimostrato in precedenza.
Centrifugare il sangue risospeso. Nel frattempo, aggiungere 200 microlitri di terreno di coltura RPMI ai pozzetti contrassegnati e preriscaldare la piastra come dimostrato. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante, lasciando circa 80 microlitri del surnatante.
Quindi aggiungere 280 microlitri di siero fetale di vitello e risospendere la tavolozza. Trasferire 180 microlitri della sospensione cellulare nei pozzetti contrassegnati. Incubare la piastra in un'incubatrice ad anidride carbonica a 37 gradi Celsius per 10 minuti.
