Dopo aver coltivato il campione di sangue crioconservato scongelato, irradiarlo con le dosi di raggi X richieste a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 1,62 millilitri di terreno di coltura RPMI caldo a ciascun pozzetto. Per stimolare la divisione cellulare nei linfociti T, aggiungere 40 microlitri di fitoemoagglutinina a ciascun pozzetto e risospendere accuratamente.
Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 23 ore. Il giorno successivo, aggiungere otto microlitri di citocalasina B per pozzetto per bloccare la citochinesi. Dopo 70 ore, rimuovere la piastra dall'incubatore e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri.
Sciacquare bene ogni pozzetto con due millilitri di PBS e aggiungere questo PBS al tubo da 15 millilitri. Centrifugare la sospensione cellulare a 180 g per otto minuti ed eliminare il surnatante, lasciando 500 microlitri sopra il pellet. Mentre si fa vorticare il pellet, aggiungere due millilitri di cloruro di potassio freddo nel tubo.
Anche in questo caso, centrifugare ed eliminare il surnatante come dimostrato in precedenza. Agitare il pellet aggiungendo lentamente due millilitri di fissativo freddo 1 e incubare per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, centrifugare e scartare il surnatante.
Mentre si fa il vortice del pellet goccia a goccia, aggiungere due millilitri di fissativo freddo 2 al tubo. Lasciare il tubo per una notte a quattro gradi Celsius. Centrifugare il campione e trasferire il surnatante in un'altra provetta per concentrare le cellule in base alle dimensioni del pellet.
Pulire i vetrini con isopropanolo ed etichettarli correttamente. Dopo aver fatto vorticare il pellet, aggiungere 40 microlitri di sospensione a celle fisse su un vetrino. Dopo l'asciugatura, immergere il vetrino in una macchia arancione acridina per un minuto.
Quindi, lavare rapidamente il vetrino con acqua distillata prima di metterlo in un tampone fosfato per un minuto. Asciugare il retro del vetrino e posizionarlo su carta velina pulita. Aggiungere 20 microlitri di tampone fosfato sul vetrino e coprirlo con un vetrino coprioggetto pulito, evitando la formazione di bolle d'aria.
Sigillare il vetrino con cemento siliconico. Posizionare il vetrino sotto un microscopio a fluorescenza ed esaminare le cellule binucleate. Infine, contare manualmente i micronuclei.
La presenza di cellule binucleate arrotondate ha indicato il successo del recupero di cellule vitali sane da campioni di sangue intero crioconservati. Con l'aumento delle dosi di radiazioni, è stato osservato un aumento quadratico lineare della resa del micronucleo. Le rese del micronucleo di fondo nei campioni di controllo irradiati con sham sono il risultato principale di cromosomi in ritardo.
