Esegui l'isolamento delle cellule di nicchia limbare, o LNC, mentre lavori in condizioni sterili su un banco di lavoro ultra-pulito. Recuperare il tessuto limbus dal mezzo di memorizzazione corneale a termine intermedio. Utilizzando una lama rotonda chirurgica sterile, raschiare e rimuovere l'iride e l'endotelio intorno alla cornea.
Successivamente, con la lama rotonda chirurgica sterile, tagliare il tessuto limbus in 12 pezzi uguali, lasciando solo un millimetro di tessuto su entrambi i lati della cornea e della sclera. Successivamente, trasferire i 12 pezzi di tessuto limbus su una piastra di coltura da 35 millimetri e aggiungere 1 millilitro di collagenasi A per immergere completamente i tessuti nella piastra. Digerire i tessuti incubando la piastra di coltura in un incubatore cellulare a 37 gradi Celsius per 18 ore.
Scongelare il matrigel o la matrice della membrana basale in frigorifero a 4 gradi Celsius. Preparare una sacca sterilizzata contenente puntali da 200 microlitri e 1 millilitro, una provetta da centrifuga da 15 millilitri e una piastra da 6 pozzetti e posizionare la sacca a meno 20 o meno 80 gradi Celsius per 20 minuti. Dopo aver recuperato i puntali, la provetta da centrifuga e la piastra a 6 pozzetti dal refrigeratore, procedere a eseguire i passaggi successivi su un banco da lavoro ultra-pulito.
Utilizzando un puntale da 200 microlitri pre-raffreddato, pipettare 50 microlitri della matrice della membrana basale scongelata in 1 millilitro di MESCM e mescolare delicatamente. Utilizzando un puntale pre-raffreddato da 1 millilitro montato su una pipetta, trasferire la matrice di membrana basale risultante al 5% in un singolo pozzetto della piastra di coltura a 6 pozzetti pre-raffreddata. Agitare delicatamente la piastra a 6 pozzetti orizzontalmente prima di metterla in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per circa un'ora per preparare la piastra di coltura rivestita di matrigel al 5%.
Dopo la digestione di 18 ore, recuperare il tessuto limbare digerito dalla collagenasi A, per lo più contenente piccoli grappoli visibili. Lavorando al microscopio stereoscopico, utilizzare un puntale di pipetta da 200 microlitri per staccare i cluster dai tessuti sclerali non digeriti. Immergere i cluster staccati in tripsina-EDTA allo 0,25% in una piastra di coltura da 35 millimetri e incubare la piastra per 15 minuti.
Quindi, aggiungere 1 millilitro di MESCM con il 10% di siero knockout alla piastra per dissetare la digestione cellulare. Pipettare delicatamente la sospensione su e giù con un puntale da 1 millilitro per rompere i cluster in singole cellule. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 millilitri e centrifugarla a 200 g per cinque minuti a temperatura ambiente.
Senza disturbare il pellet cellulare, rimuovere con cautela il surnatante e aggiungere 1 millilitro di MESCM per risospendere le cellule. Utilizzando un puntale per pipette da 1 millilitro, pipettare il contenuto su e giù due o tre volte per garantire che l'intero pellet sia risospeso nel MESCM. Raccogliere 20 microlitri dalla sospensione per il conteggio delle cellule.
Successivamente, utilizzando una pipetta da 1 millilitro, trasferire la sospensione cellulare nella piastra a 6 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale al 5%. Aggiungere MESCM per rendere il volume totale nel pozzetto di 2,5 millilitri. Agitare delicatamente la piastra a 6 pozzetti orizzontalmente per garantire una distribuzione uniforme delle cellule.
Dopo aver eseguito l'imaging delle cellule, trasferirle in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius. Il protocollo dimostrato ha digerito con successo il tessuto del bordo sclerale della cornea, generando cluster che potevano essere visualizzati al microscopio. Come previsto, i grappoli assomigliavano alla forma di un bruco.
I LNC primari sono cresciuti lentamente e hanno richiesto circa 12 giorni per la coltura. Gli LNC dal passaggio 1 al passaggio 8 hanno richiesto circa tre giorni per il passaggio, ma il tasso di crescita degli LNC dopo il passaggio 9 è diminuito in modo significativo. Morfologicamente, gli LNC erano a forma di fuso e rotondi nel passaggio 0.
Dopo il passaggio 3, erano a forma di fuso con dimensioni uniformi. Il numero di raddoppi cellulari o NCD rappresentava il tasso di crescita degli LNC. Le curve NCD e NCD cumulative hanno rivelato che gli LNC sono cresciuti più velocemente dal passaggio 3 al passaggio 5.
