Per identificare le cellule di nicchia limbare o LNC mediante colorazione a immunofluorescenza, aggiungere 1 millilitro di EDTA allo 0,25% di tripsina per pozzetto alle LNC coltivate in una piastra a 6 pozzetti rivestita di matrigel al 5%. Digerire le cellule incubando la piastra per cinque minuti a 37 gradi Celsius. Estinguere la digestione aggiungendo 1 millilitro di siero knockout contenente MESCM alla sospensione cellulare.
Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga e centrifugarla a 200 G per cinque minuti prima di aspirare con cautela il surnatante. Risospendere il pellet in un millilitro di MESCM. Successivamente, utilizzando un citofugo, depositare 80 microlitri della sospensione cellulare in parti uguali su quattro vetrini da microscopio secondo le istruzioni del produttore.
Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per circa 10 minuti. Quindi permeabilizzare le cellule sui vetrini utilizzando lo 0,2% di Triton X-100 in PBS per 15 minuti. Bloccare le cellule con albumina sierica bovina al 2% per un'ora prima di incubarle con gli anticorpi primari su uno shaker per una notte a 4 gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, rimuovere gli anticorpi non legati lavando i vetrini con PBST tre volte per cinque minuti ciascuna. Successivamente, incubare il campione con anticorpi secondari idonei a 37 gradi Celsius per un'ora prima di lavare eventuali anticorpi non legati, come dimostrato in precedenza. Contrastare i nuclei con DAPI avente una concentrazione di 5 microgrammi per millilitro.
Dopo aver sigillato i vetrini, eseguire l'imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza. Utilizzando un kit di isolamento dell'RNA, estrarre l'RNA totale dagli LNC secondo le istruzioni del produttore. Quindi, utilizzando un kit di trascrizione di DNA complementare o CDNA ad alta capacità, trascrivere inversamente da 1 a 2 microgrammi di RNA.
Preparare una soluzione da 20 microlitri contenente 2,5 microlitri di CDNA, 0,8 microlitri di primer genetico corrispondente, 10 microlitri di una miscela master PCR universale e 6,7 microlitri di acqua bidistillata. Quindi eseguire una reazione a catena della polimerasi quantitativa utilizzando le condizioni appropriate. Infine, utilizzare la tecnica TC comparativa per esaminare l'espressione genica relativa.
La doppia immunocolorazione degli LNC di quarto passaggio ha rivelato chiaramente che queste cellule erano costantemente panCK negative, VIM positive, CD90 positive, CD105 positive, SCF positive e PDGFR positive.
