Calcium Imaging of Drosophila Ex Vivo Brain for Epileptiform Analysis

Per iniziare, perfondere la soluzione esterna con soluzione fisiologica ossigenata per cinque minuti. Con una pipetta, trasferire 10 microlitri della soluzione di dissezione in una capsula di Petri. Ora, usa aghi da siringa e un microscopio per sezionare attentamente il cervello delle mosche anestetizzate e knockout.

Con una pipetta, trasferire il cervello preparato in un piatto di registrazione con cinque millilitri di soluzione esterna. Immobilizzare il cervello con un supporto per Do acuto. Successivamente, cattura l'immagine confocale di ciascun cervello a 20x.

Usa la modalità di scansione XYT e identifica i neuroni del corpo del fungo con un'ulteriore amplificazione digitale di 4,5 volte. Imposta l'eccitazione laser a 488 nanometri con una potenza laser di 16 micro watt per acquisire l'emissione GCaMP6m dell'intero cervello. Quindi impostare i parametri di scansione su una velocità di 1400 con una dimensione dei pixel di 256 x 256 pixel.

Impostare la velocità di acquisizione a 5,3 hertz e registrare per tre minuti. Analizza la fluorescenza di cinque-otto regioni di interesse. Determinare manualmente il corpo cellulare dei neuroni del corpo del fungo come regione di interesse.

Usa l'immagine J per etichettare i neuroni identificati e misurare la loro intensità di fluorescenza. Analizzare i dati di fluorescenza di GCaMP6m come mostrato. Definire la fluorescenza intracellulare che aumenta tra due e 2,5 deviazioni standard come piccoli picchi e quelli che aumentano più di 2,5 deviazioni standard come grandi picchi.

I segnali di calcio sono stati osservati nel corpo dei funghi delle mosche. Le mosche da knockdown del cac hanno mostrato più picchi grandi che piccoli.