Per iniziare, prelevare il campione di vescicola extracellulare essiccata ottenuto dall'urina umana utilizzando l'approccio della trappola EV. Preparare un nuovo tampone di lisi con i componenti mostrati. Quindi aggiungere 100 microlitri di tampone di lisi per solubilizzare il campione EV essiccato.
Riscaldare il campione a 95 gradi Celsius per 10 minuti agitando a 1.100 giri/min. Dopo aver raffreddato il campione a temperatura ambiente, diluirlo quintuplicando aggiungendo 400 microlitri di TEAB 50 millimolari. Misurare la concentrazione proteica utilizzando un kit di test BCA secondo le istruzioni del produttore.
Aggiungere la miscela di tripsina e lisina C al campione e incubare a 37 gradi Celsius per una notte con agitazione a 1.100 giri/min. Quindi aggiungere 50 microlitri di acido trifluoroacetico al 10% o TFA per acidificare il campione. Inoltre, aggiungere 600 microlitri di acetato di etile ai campioni e vorticare la miscela per due minuti.
Centrifugare il campione per tre minuti a 20.000 G e rimuovere con cautela lo strato superiore senza disturbare l'interfaccia. Essiccare la fase acquosa utilizzando un concentratore centrifugo sottovuoto. Ora risospendere il campione essiccato in 200 microlitri di TFA allo 0,1% per acidificare i peptidi.
Per dissalare il campione, utilizzare un puntale di dissalazione CA18 e condizionarlo con 200 microlitri di TFA allo 0,1% e acetonitrile all'80%, seguiti da due lavaggi con 200 microlitri di TFA allo 0,1%. Caricare il campione di peptide acidificato nella punta e lavarlo tre volte con 200 microlitri di TFA allo 0,1%. Eluire i peptidi con 200 microlitri di TFA allo 0,1% e acetonitrile all'80%.
Dopo aver prelevato l'eluente come dimostrato, risospendere il campione essiccato in fosfoproteomica in 200 microlitri di tampone di carico per l'arricchimento di fosfopeptidi. Aggiungere 50 microlitri di microlitri di microsfere al campione e agitare energicamente per 20 minuti a temperatura ambiente. Caricare il campione con le perle nella punta fritta e centrifugare per un minuto a 100 G.Lavare la punta successivamente con 200 microlitri di tampone di carico, lavando i tamponi uno e due.
Posiziona la punta con le perline in un nuovo tubo per raccogliere i fosfopeptidi elusi. Aggiungere 50 microlitri di tampone di eluizione al puntale e centrifugare per due minuti a 20 G. Quindi asciugare i fosfopeptidi elusi utilizzando un concentratore per centrifuga sottovuoto.
