Per iniziare, preparare campioni di proteoma e fosfoproteoma delle vescicole extracellulari isolate dai campioni di urina utilizzando l'approccio EVtrap. Iniettare i campioni nello spettrometro di massa a tempo di volo a mobilità ionica intrappolata attraverso il sistema di cromatografia liquida. Separare i peptidi in una colonna di C18 di 15 centimetri.
Per l'analisi proteomica, acquisire i dati utilizzando il metodo dia-PASEF con un intervallo di massa per rampa da 300 a 1200 rapporto massa-carica e costante di mobilità ionica da 0,6 a 1,50 1/nodo. Per l'analisi fosfoproteomica, acquisire i dati utilizzando un metodo di acquisizione dia-PASEF. Impostare l'intervallo di massa per rampa in modo che vada da 400 a 1550, il rapporto massa-carica nella costante di mobilità ionica sia compreso tra 0,6 e 1,50 1/nodo.
Carica i file grezzi nel software di proteomica. Impostare i parametri di ricerca nel database dell'homo sapiens. Per Tipo di digest, selezionare Specifico e in Enzimi selezionare TripsinP.
Definire la lunghezza del peptide da un minimo di 7 a un massimo di 52 e consentire due scissioni mancate. Quindi impostare il valore di Maximum Variable Modifications (Modifiche variabili massime) su 5. La modifica fissa dovrebbe essere carbamidometilico a Cistina, mentre le modifiche variabili dovrebbero includere la proteina Acetil N-terminale, l'ossidazione a Metionina e la fosforilazione a Serina, Treonina e Tirosina.
Infine, impostare il tasso di falsa scoperta per la corrispondenza dello spettro peptidico, il peptide e il gruppo proteico su 0,01. Nel profilo proteomico LCMS e MS, il 2% di ciascun campione ha rivelato oltre 11.000 peptidi unici da circa 2.200 proteine. In particolare, il 72% delle proteine uniche è stato trovato in modo coerente in tutte e tre le repliche e sono stati identificati 90 marcatori e proteine EV principali rispetto al database ExoCarta.
La precisione quantitativa è stata confermata con un coefficiente di variazione medio-basso del 5,7%, a significare un'elevata riproducibilità e affidabilità. Per quanto riguarda la fosfoproteomica, il 98% di ciascun campione peptidico ha prodotto 800 fosfopeptidi unici e 350 fosfoproteine. L'arricchimento ha portato al 72% di fosfoserina, al 22% di fosfotreonina e al 6% di peptidi di fosfotirosina.
Il 42% dei fosfopeptidi è stato identificato in tutte le repliche con un coefficiente medio di variazione del 21,8%, che indica un'accettabile riproducibilità quantitativa.
