Per iniziare, coltivare le cellule in DMEM Complete Medium contenente il 10% di FBS e il 5% di penicillina-streptomicina in una piastra a sei pozzetti. Incubare la coltura per una notte a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, co-coltivare le cellule con 10 nanoparticelle nanomolari di ossido di ferro modificato con polilisina o IONP e incubare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 12 ore.
Dopo l'incubazione, aggiungere 0,5 millilitri di tripsina per pozzetto per tre minuti per digerire le cellule. Quindi aggiungere un millilitro di Complete Medium per pozzetto per fermare la digestione. Centrifugare la sospensione cellulare a 1.000 g per cinque minuti ed eliminare il surnatante prima di risospendere il pellet in PBS.
Quindi sospendere nuovamente il pellet in otto millilitri di soluzione ipotonica appena preparata per 15 minuti. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta di vetro e, utilizzando un omogeneizzatore di vetro, applicare 20 scosse a 1.000 giri/min per rilasciare gli organelli. Dopo l'omogeneizzazione, trasferire un millilitro della sospensione cellulare in una provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Posizionare la provetta in un separatore magnetico per un'ora per separare completamente gli endosomi caricati con IONP da altri organelli e detriti cellulari. Per raccogliere gli endosomi, scartare il liquido dalla provetta e aggiungere tre millilitri di PBS per risospendere gli endosomi. Quindi utilizzare una pistola a pipetta per soffiare per risospendere i pellet marroni che si trovano sulla superficie di contatto del tubo accanto al telaio magnetico.
Per l'omogeneizzazione ad alta velocità, trasferire la soluzione endosomica in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Posizionare la ghiacciaia sotto il tubo, quindi posizionare il tubo sull'omogeneizzatore ad alta velocità. Posizionare la sonda da 10 millilitri nel tubo senza toccare il fondo.
Sullo schermo dell'omogeneizzatore, regolare la velocità a 140 g e impostare il tempo per cinque minuti. Premere il pulsante OK seguito dal pulsante Start. Dopo l'omogeneizzazione ad alta velocità, trasferire la sospensione di nano-vescicole in una provetta da 1,5 millilitri e posizionare la provetta in un separatore magnetico per un'ora.
Infine, raccogli il liquido contenente i mimici esosomi o EM richiesti senza disturbare la superficie accanto al telaio magnetico. La morfologia dei BMSC-EM analizzati mediante NTA e TEM ha mostrato una tipica struttura vescicolare a forma di ciotola, delimitata da un doppio strato lipidico. Sia i BMSC-EM che i 293T-EM avevano un diametro idrodinamico simile a quello degli EV nativi.
I risultati del Western blotting hanno mostrato che le BMSC-EM contengono gli stessi biomarcatori proteici delle vescicole extracellulari e non presentano quasi alcuna contaminazione della membrana plasmatica. La resa dell'EMS è risultata significativamente superiore rispetto alle vescicole extracellulari native preparate mediante ultracentrifugazione. Gli EM avevano una composizione proteica simile a quella delle EV native.
