Removal of Debris and Red Blood Cells from CNS Cell Suspension of EAE Mice

Per iniziare, ottenere un pellet cellulare dopo la dissociazione del tessuto del SNC e risospenderlo con 3.100 microlitri di DPBS in una provetta da 15 millilitri. Non vorticare. Aggiungere 1.800 microlitri della soluzione per la rimozione dei detriti dal kit di dissociazione cerebrale per adulti a due sospensioni di cellule del SNC raggruppate.

Capovolgere il tubo e mescolare la sospensione, quindi sovrapporla delicatamente con 4 millilitri di DPBS freddo e osservare un chiaro gradiente. Centrifugare le provette per 10 minuti a 3.000 g a 4 gradi Celsius con la massima accelerazione e senza interruzioni. Dopo la centrifugazione, si formano tre fasi.

Aspirare completamente le due fasi superiori e scartarle, assicurandosi che non rimangano residui di mielina. Riempire il tubo con DPBS freddo fino a 14 millilitri e chiuderlo. Capovolgere il tubo con forza sul banco di lavoro fino a quando il pellet cellulare non si stacca dal fondo del tubo.

Centrifugare il campione e aspirare completamente il surnatante. Per la rimozione dei globuli rossi, aggiungere 1 millilitro della soluzione di rimozione dei globuli rossi al pellet cellulare. Dopo aver risospeso il pellet, incubare la soluzione per 10 minuti a 4 gradi Celsius.

Quindi aggiungere 10 millilitri di tampone PB freddo, centrifugare il campione e aspirare completamente il surnatante. Per la conta cellulare, diluire la sospensione cellulare di 50 volte in tampone PB e poi di 1-10 diluizioni in soluzione di blu di tripano allo 0,4%. Quindi determinare il conteggio delle cellule, utilizzando una camera di conteggio migliorata.