Per iniziare, posizionare il reagente di dissociazione cellulare HBSS EGM-2 e DMEM in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 10-15 minuti. Scongelare la trombina e la laminina durante la notte a 4 gradi Celsius e il fibrinogeno a temperatura ambiente. Aggiungere 1,5 microlitri di trombina in una provetta da microcentrifuga da 500 microlitri.
Posizionare una piastra ad alto rendimento sterilizzata con UV in un essiccatore per 30 minuti per rimuovere l'aria intrappolata nella microfluidica. Posizionare il pallone T75 sotto il microscopio con un ingrandimento 4x per confermare la confluenza cellulare e l'efficienza di trasduzione. Lavare le cellule due volte con cinque millilitri di HBSS.
Quindi, aggiungere un millilitro di reagente di dissociazione al matraccio e incubare a 37 gradi Celsius con anidride carbonica al 5% per uno o due minuti. Picchiettare delicatamente il pallone con il palmo della mano e osservare al microscopio che tutte le cellule sono state sollevate. Lavare le cellule con nove millilitri di terreno appropriato e raccogliere la sospensione in un tubo conico da 15 millilitri.
Rimuovere immediatamente una piccola aliquota e contare le celle. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 G e quattro gradi Celsius per tre-cinque minuti. Quindi, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in un terreno appropriato su ghiaccio.
Usando l'equazione data, calcola il numero di celle necessarie. Risospendere le cellule a una concentrazione da 1 volte 10 a 6 cellule per millilitro e calcolare il volume di cellule necessario utilizzando la seguente equazione. Centrifugare il volume richiesto di sospensione cellulare come dimostrato.
Quindi, in un volume calcolato di fibrinogeno, risospendere il pellet sul ghiaccio.
