Per iniziare, posizionare le piastre ad alto rendimento sterilizzate con raggi UV e le aliquote di trombina nella cappa per coltura tissutale. Mettere la miscela di fibrina cellulare preparata sul ghiaccio per rallentare la coagulazione. Utilizzando una pipetta P20, prelevare sei microlitri della miscela di fibrina cellulare.
Quindi posizionare delicatamente il puntale della pipetta nell'aliquota di trombina e mescolare due volte senza introdurre bolle d'aria. Sollevare la piastra ad alta produttività inclinandola e inserire rapidamente il puntale della pipetta in una delle porte di caricamento. Spingere lo stantuffo della pipetta fino al primo arresto con un movimento fluido e regolare e iniettare la miscela di fibrina cellulare nella camera del tessuto.
Assicurarsi che il gel attraversi completamente la camera. Posizionare delicatamente la piastra in piano senza rimuovere il puntale della pipetta o spostare la pipetta. Rimuovere il puntale della pipetta con una mano dal P20 e lasciarlo nel foro della porta di caricamento.
Dopo due minuti, rimuovere i puntali delle pipette con delicati movimenti di torsione dalle porte di caricamento e posizionare il coperchio sulla piastra. Incubare la piastra per 15-20 minuti a 37 gradi Celsius per la polimerizzazione del gel. Posizionare il dispositivo microfluidico sul tavolino del microscopio per osservare la distribuzione uniforme delle cellule in tutta la camera senza bolle d'aria.
Inserire il puntale della pipetta P20 in M1 o M3 ed espellere lentamente quattro microlitri di laminina per rivestire l'intero pannello superiore. Rimuovere il puntale della pipetta come mostrato in precedenza e incubare la piastra a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per 10 minuti. Aggiungere 275 microlitri di terreno completo EGM-2 ai serbatoi disaccoppiati dei pozzetti situati nelle file A e B.Inserire il puntale della pipetta P200 nel foro di ingresso del terreno di coltura contenente 275 microlitri di EGM-2 ed espellere lentamente 75 microlitri di terreno, osservando il terreno viaggiare attraverso il canale e gorgogliare dall'altro lato.
Dopo aver rimosso il puntale della pipetta, spingere il terreno rimanente dal puntale nel serbatoio del terreno. Aggiungere 50 microlitri di terreno per coprire interamente i pozzetti laterali inferiori nelle file G e H.Incubare le piastre per una o due ore come dimostrato. Al microscopio, identificare eventuali bolle nei canali dei supporti e rimuoverle reintroducendo 75 microlitri di materiale nei canali.
Controllare gli ingressi o le uscite del fluido per le bolle d'aria ad occhio nudo. Quindi inserire il puntale della pipetta P200 nel foro ed estrarre la bolla sollevando lo stantuffo. Nei microorgani vascolarizzati o VMO, le cellule endoteliali inizialmente si distribuivano uniformemente all'interno della camera tissutale, ma dal secondo giorno hanno iniziato ad allungarsi e a illuminarsi.
Entro il quarto giorno, le cellule endoteliali si sono anastomosizzate con i canali microfluidici esterni, formando una rete vascolare continua. La stretta funzione di barriera vascolare è stata confermata dalla perfusione del destrano FITC attraverso la rete microvascolare con perdite minime. La perfusione di cellule tumorali MDA-MB-231 nei VMO ha provocato la loro adesione al rivestimento endoteliale e il successivo stravaso nello spazio extracellulare, formando micrometastasi multiple entro 24 ore dalla perfusione.
Attraverso l'imaging microscopico time-lapse, è stato osservato lo stravaso di cellule T nello spazio extracellulare dei VMO per oltre 45 minuti. Nei microtumori vascolarizzati con vasi completamente formati, le cellule T hanno aderito rapidamente alla parete vascolare dopo la perfusione.
