Per iniziare a utilizzare una pipetta sierologica, rimuovere il terreno di coltura dal matraccio T75 contenente il 70% di coltura MDA-MB-231 confluente. Aggiungere tre millilitri di tripsina al pallone e incubare a 37 gradi con anidride carbonica al 5% per tre-cinque minuti per staccare le cellule dal pallone. Quindi, per neutralizzare la tripsina, aggiungere tre millilitri di DMEM nel pallone.
Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga e centrifugare a 400 G per quattro minuti. Scartare il surnatante utilizzando una pipetta e risospendere il pellet in due millilitri di PBS. Utilizzando un contatore di cellule, determinare la concentrazione cellulare.
Trasferire otto volte 10 alla quinta cella in una provetta da 15 millilitri e aggiungere PBS per portare il volume a un millilitro. Quindi aggiungere due microlitri di CFSE nella provetta e mescolare accuratamente la sospensione cellulare utilizzando una pipetta da un millilitro. Posizionare il tubo a 37 gradi Celsius e incubatrice al 5% di anidride carbonica per 20 minuti.
Successivamente, aggiungere cinque millilitri di DMEM alla provetta e centrifugare per pellettare le cellule marcate CFSE. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di DMEM. Dopo aver rivalutato la concentrazione cellulare, trasferire quattro volte 10 alle quinte cellule in un serbatoio di reagenti da 25 millilitri.
Aggiungere DMEM per portare il volume a otto millilitri e miscelare la sospensione cellulare con una pipetta sierologica da cinque millilitri. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire 100 microlitri di sospensione cellulare in ciascuna fila sulla metà sinistra di una piastra nera a 96 pozzetti. Allo stesso modo, aggiungere la sospensione di cellule knockout EGFR sulla metà destra della piastra.
Per garantire una distribuzione uniforme delle celle, spostare la piastra avanti e indietro e da un lato all'altro sulla piattaforma. Incubare la piastra per quattro ore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica affinché le cellule tumorali si attacchino. Sulla base dei conteggi delle cellule Jurkat non trasdotte ed esprimenti CAR, trasferire quattro volte 10 alle quinte cellule CAR-J in un serbatoio da 25 millilitri.
Aggiungere DMEM al serbatoio fino a un volume finale di due millilitri. Per un rapporto effettore/tumore di 4:1, aggiungere due volte 10 al quarto cellule CAR-J per pozzetto in 100 microlitri di terreno lungo il lato del pozzetto senza disturbare le cellule tumorali attaccate. Quindi aggiungere 100 microlitri di DMEM sul lato dei pozzetti contenenti cellule tumorali e Jurkat per ottenere 300 microlitri di volume per pozzetto.
Spostare la piastra come dimostrato per garantire una distribuzione uniforme delle cellule Jurkat sulle cellule tumorali. Lasciare che la co-coltura si stabilisca a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 48 ore.
