Dopo aver co-coltivato jurkats che esprimono CAR con cellule tumorali marcate con CFSE, capovolgere delicatamente la piastra su un tovagliolo di carta e picchiettare per scartare i surnatanti contenenti CAR-J. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 microlitri di terreno DMEM FluoroBrite contenente propidioiodio, o PI, nei pozzetti senza disturbare le cellule tumorali aderenti. Quindi aggiungere 20 microlitri di Tritone X al 20% al primo pozzetto di ciascun tipo di tumore, fungendo da controllo totale dei morti.
Incubare la piastra a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al 5% per 20 minuti prima dell'imaging. Dopo l'imaging fluorescente, utilizzare uno dei pozzetti di cellule solo tumorali per calibrare il canale fluorescente verde. Per escludere le cellule sul bordo dei pozzetti, ridurre la maschera del pozzetto al 98%Identificare le cellule tumorali marcate con CFSE sul canale fluorescente verde e regolare il valore della soglia di intensità della fluorescenza per catturare tutte le cellule nel pozzetto.
Impostare il diametro minimo della cella su 25 micrometri per escludere i detriti rilevati nel canale CFSE. Quindi abilita gli oggetti che si toccano separati per identificare le singole celle. Successivamente, è stato possibile definire le popolazioni di cellule vive rispetto a quelle morte.
Selezionare le celle marcate CFSE e generare un istogramma di conteggi sull'asse y rispetto all'intensità PI media sull'asse x. Regolare il valore dell'asse x per visualizzare meglio le celle e disegnare uno splitter per distinguere tra le cellule colorate con PI basso e le cellule colorate con PI alto. Etichettare le cellule colorate con PI basso come cellule vive.
Successivamente, imposta un altro istogramma sulle cellule vive con l'area sull'asse x e i conteggi sull'asse y. Etichettare le cellule non detritiche come grandi cellule vive. Quindi disegna un altro splitter usando bene il tumore solo per catturare le cellule e filtrare i detriti.
Dopo aver eseguito l'analisi sull'intera piastra, esportare il foglio di calcolo contenente i numeri. Tracciare la conta delle grandi cellule per determinare il numero di cellule tumorali vive marcate con CFSE rimaste nel pozzetto dopo l'esposizione a CAR-J. Infine, eseguire l'analisi statistica utilizzando l'ANOVA unidirezionale.
La citotossicità di CAR-J1 è aumentata con un rapporto effettore/tumore più elevato e più del 50% di uccisione è stata osservata con un rapporto effettore/tumore di quattro a uno. I costrutti CAR mirati all'EGFR con domini cerniera modificati hanno mostrato un'uccisione antigene-specifica contro le cellule MDA-MB-231 che esprimono EGFR e non è stata osservata alcuna uccisione significativa contro le cellule knockout dell'EGFR. I costrutti CAR sono stati espressi anche su cellule T CD3 derivate da PBMC.
Tuttavia, non c'è stata alcuna espressione di EGFR-CAR contenente cerniera CD8. Le IgG corte hanno mostrato la minore potenza citotossica contro le cellule MDA-MB-231 rispetto alle IgG lunghe e alle IgG medie.
