Per iniziare, risospendere i neutrofili di ratto isolati in quattro millilitri di terreno RPMI integrato in una capsula di Petri sterile da 10 centimetri. Successivamente, aggiungere quattro microlitri di PMA alla sospensione dei neutrofili per innescare la formazione di NET. Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per tre ore sotto il 5% di anidride carbonica.
Per il controllo negativo, aggiungere da quattro a cinque microlitri di DNASE1 alla sospensione dei neutrofili per degradare i NET secreti. Quindi, aggiungi quattro millilitri di HBSS per lavare i NET. Sciacquare la piastra con quattro millilitri di terreno di coltura fresco per ciascuna piastra per staccare i NET.
A questo punto, raccogliere frequentemente il mezzo di lavaggio in una nuova provetta e pipetta per garantire la completa risospensione dei NET. Centrifugare la sospensione a 300 g per 10 minuti a 20 gradi Celsius per rimuovere eventuali cellule galleggianti. Quindi, raccogliere il terreno surnatante con i NET in una nuova provetta.
Centrifugare la sospensione di NET e cellule galleggianti in una piastra da 24 pozzetti con vetrini di vetro da 1,4 centimetri posizionati per depositare eventuali cellule galleggianti. Quindi, fissare le celle sui vetrini coprioggetto con PFA al 4% e procedere alla verifica della presenza dei NET. Successivamente, posizionare una goccia di HBSS su un supporto per provette ricoperto di film di paraffina.
Capovolgere la vetrina di copertura nelle goccioline HBSS per lavarla. Dopo il lavaggio, incubare le cellule in 250 microlitri di Triton X-100 0,5x per 10 minuti a temperatura ambiente per permeabilizzarle. Quindi, lavare le cellule tre volte in HBSS per un minuto.
Sigillare le cellule in siero d'asina normale al 10% a temperatura ambiente per un'ora. Infine, incubare le cellule con 70-90 microlitri di anticorpi anti-ratto durante la notte a quattro gradi Celsius. Lavare il vetrino coprioggetto in HBSS tre volte per cinque minuti ciascuna.
Ora, incubare il vetrino coprioggetto negli anticorpi secondari a temperatura ambiente per un'ora al buio prima di lavare un HBSS. Colorare i nuclei cellulari e gli scheletri di NET in 70-90 microlitri di DAPI. Eseguire il lavaggio HBSS tre volte per cinque minuti ciascuna.
