Per eseguire l'estrazione del DNA, aggiungere prima una quantità appropriata di soluzione di lisi cellulare al pellet cellulare ottenuto dall'umore oculare. Pipettare la soluzione su e giù per mescolarla accuratamente. Una volta che le cellule sono completamente lisate, aggiungere una soluzione di precipitato proteico per costituire un terzo del volume totale.
Ora, vorticare e mescolare energicamente per 20-30 secondi. Quindi centrifugarlo per tre minuti a 3000 g a temperatura ambiente. Nel frattempo, trasferire 300 microlitri di isopropanolo in una provetta per microcentrifuga pulita.
Una volta completata la centrifugazione, pipettare con cura il surnatante nella provetta contenente isopropanolo. Quindi, aggiungi 1,5 microlitri di glicogeno al tubo e capovolgi il tubo per mescolare accuratamente. Metti la provetta a meno 20 gradi Celsius in un congelatore per un'ora o per tutta la notte per facilitare la precipitazione del DNA.
Dopo il congelamento, centrifugare la provetta per cinque minuti a 3000 g a temperatura ambiente. Quindi, pipettare l'isopropanolo. Per lavare il pellet, aggiungere 0,5 millilitri di etanolo al 70%.
Capovolgere delicatamente il tubo per garantire un lavaggio uniforme. Quindi centrifugare il tubo per un minuto a 3000 g a temperatura ambiente. Eliminare il surnatante dalla provetta da centrifuga.
Ora, capovolgere il tubo su una garza pulita per drenare la soluzione e asciugare il pellet. Dopo un rapido giro nella microcentrifuga, utilizzare un puntale per pipetta monouso a punta fine per pipettare la gocciolina di etanolo rimanente. Successivamente, aggiungere 45 microlitri di soluzione di idratazione del DNA al pellet di DNA essiccato.
Quindi posizionare il tubo in un blocco riscaldante impostato a 50 gradi Celsius. I rendimenti del DNA dei componenti cellulari e privi di cellule dei fluidi oculari erano simili. È stata eseguita l'analisi PCR dei componenti cellulari e privi di cellule di una mutazione associata al linfoma vitreoretinico.
Un tasso di mutazione più elevato era presente nella componente priva di cellule, come dimostrato da una soglia di ciclo abbassata.
