Per iniziare, rimuovi il midollo spinale di un topo decapitato che è stato perfuso con PBS. Immergere il midollo spinale in DPBS freddo in una capsula di Petri con ghiaccio. Con un ago calibro 18 e una siringa da 10 millilitri riempita di DPBS freddo, utilizzare l'estrusione idraulica per isolare l'intero midollo spinale in una cappa a flusso laminare.
Trasferire il midollo spinale in una capsula di Petri con DPBS freddi posti su impacchi di ghiaccio. Utilizzando un microscopio all'interno della cappa a flusso laminare, rimuovere con cautela eventuali meningi visibili con una pinza affilata. Quindi, trasferisci il midollo spinale in una capsula di Petri vuota e usa una lama di bisturi chirurgico n. 10 per tagliarlo in sezioni lunghe da due a tre millimetri.
Per la dissociazione enzimatica delle cellule spinali, aggiungere le miscele enzimatiche 1 e 2 ai pezzi del midollo spinale. Far roteare più volte gli enzimi nel piatto per garantire un rivestimento uniforme del midollo spinale. Incubare il piatto a 37 gradi Celsius per 30 minuti, facendo roteare manualmente il piatto ogni 10 minuti.
Dopo l'incubazione, aggiungere 350 microlitri di DNAse I.Agitare delicatamente la piastra per mescolare. Successivamente, aggiungere un millilitro di DMEM freddo integrato con lo 0,5% di FBS prima di mescolare delicatamente. Trasferire immediatamente l'intero contenuto in un tubo da cinque millilitri.
Con una pipetta P1000, triturare delicatamente il tessuto tre volte. Quindi, utilizzare una pipetta Pasteur in vetro da nove pollici tappata per triturare delicatamente il tessuto altre cinque volte. Posizionare il tubo in posizione verticale per 30 secondi per consentire al tessuto di depositarsi.
Con una pipetta P1000, aspirare il surnatante e trasferirlo attraverso un filtro da 30 micrometri in una provetta conica da 15 millilitri. Alla provetta con i tessuti rimanenti, aggiungere un millilitro di DMEM integrato con FBS. Quindi, triturare delicatamente tre volte con una pipetta Pasteur.
Dopo aver lasciato che il tessuto si depositasse sul fondo, far passare il surnatante attraverso un filtro da 30 micrometri e raccoglierlo nella stessa provetta da 15 millilitri utilizzata in precedenza. Centrifugare la sospensione cellulare filtrata a 300 g per 10 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare un aspiratore sottovuoto per scartare con cura il surnatante.
Utilizzare la soluzione per la rimozione dei detriti fornita nel kit di dissociazione cerebrale per adulti per rimuovere la mielina dal pellet cellulare. Quindi, aggiungi cinque millilitri di DMEM integrato con FBS al pellet e capovolgi delicatamente il tubo tre volte per mescolare. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in un millilitro di DPBS integrato con FBS.
Centrifugare di nuovo prima di scartare il surnatante. Etichettate le celle con Microsfere Anti-ACSA-2 seguendo il protocollo del produttore. Utilizzare le colonne di separazione magnetica per separare le celle mediante selezione positiva.
Quindi, centrifugare le cellule a 300 g per 10 minuti prima di scartare il surnatante. Successivamente, risospendere il pellet cellulare in un millilitro di DMEM caldo integrato con FBS. Trasferire la sospensione cellulare su un emocitometro per contare le cellule e valutarne la vitalità.
Regola la concentrazione cellulare a 75.000 cellule per 50 microlitri con FBS DMEM. Quindi, trasferire 50 microlitri della sospensione cellulare in un vetrino coprioggetti rivestito di poli-l-lisina in una piastra a 24 pozzetti. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per due ore per consentire alle cellule di aderire al vetrino coprioggetti.
Quindi, aggiungere con cura 450 microlitri di FBS DMEM caldo e integrato con antibiotici a ciascun pozzetto. Sono stati osservati l'isolamento e la proliferazione di microglia e astrociti. Al quarto giorno, è stato osservato che gli astrociti formavano processi più lunghi, mentre sono state osservate cellule microgliali ovali con fusi più corti.
Gli astrociti formavano uno strato confluente connesso entro il settimo giorno, con la microglia che mostrava processi sempre più brevi. Lo smistamento cellulare ha confermato una vitalità cellulare del 92-93% della coltura cellulare isolata.
