Dissociazione delle cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali embrionali umane e determinazione ottimale della fase di crioconservazione

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November 3rd, 2023

DOI :

10.3791/200823-v

November 3rd, 2023

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Xinyue Bai*¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Ting Zhang*¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xinyue Zhu¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xianyu Huang¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Haiyun Liu¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xiaoyan Ding⁸, Mei Jiang¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xiaodong Sun¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷

¹Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, ²National Clinical Research Center for Eye Diseases, ³Shanghai Clinical Research Center for Eye Diseases, ⁴Shanghai Key Clinical Specialty, ⁵Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases, ⁶Shanghai Engineering Center for Visual Science and Photomedicine, ⁷Shanghai Engineering Center for Precise Diagnosis and Treatment of Eye Diseases, ⁸Stem Cell Core Facility, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Chinese Academy of Sciences

* Questi autori hanno contribuito in egual misura

Trascrizione

Per iniziare, diluire una fiala di matrice di membrana basale fredda scongelata con 12 millilitri di DM EM F12. Mescola bene le sospensioni. Aggiungere un vetrino di copertura in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.

Quindi, pipettare 250 microlitri della soluzione della matrice diluita in ciascun pozzetto. Scartare il terreno di coltura delle piastre cellulari epiteliali pigmentate retiniche derivate da hESC in coltura. Lavare le piastre due volte con un millilitro di PBS preriscaldato per pozzetto.

Quindi, aggiungere 0,5 millilitri del reagente di dissociazione cellulare ai pozzetti delle piastre di coltura e incubarli a 37 gradi Celsius per 15 minuti per avviare la digestione. Dopo l'incubazione, osservare le cellule al microscopio per confermare la fine della digestione. Ora con una pipetta da un millilitro, pipettare delicatamente la sospensione cellulare su e giù per 10 volte.

Aggiungere il terreno di coltura preriscaldato per diluire la sospensione. Quindi, centrifugarlo a 250 G per tre minuti a temperatura ambiente. Versare il surnatante dalla provetta da centrifuga.

Quindi, risospendere il pellet cellulare in due millilitri di terreno di coltura. Utilizzare una pipetta per mescolare le cellule da 10 a 15 volte. Filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri.

Successivamente, conta le cellule epiteliali del pigmento retinico. Aspirare la soluzione di rivestimento prima della placcatura. Quindi, aggiungere un millilitro di terreno di coltura in ciascun pozzetto e seminare le cellule sui vetrini coprioggetti.

Dopo l'incorporazione e la colorazione dell'EDU, acquisire le immagini di cinque campi casuali con un microscopio a fluorescenza. Calcola la percentuale di celle EDU positive. Quindi, tracciare le corrispondenti curve temporali di proporzione per generare una curva di crescita.

Infine, determinare la finestra di congelamento dalla fase esponenziale per ciascuna linea cellulare. Le cellule epiteliali pigmentate retiniche hanno inizialmente perso la loro caratteristica morfologia esagonale, ma in seguito l'hanno riacquistata nella fase esponenziale di crescita. Quando le cellule sono state coltivate per un'ulteriore settimana, la proliferazione cellulare è diminuita.

Il test di proliferazione EDU ha confermato che le cellule P2 del quinto giorno mostravano un tasso di proliferazione più elevato, mentre le cellule P2 del giorno 11 erano entrate nella fase di decelerazione.

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