Conservazione delle cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da cellule staminali embrionali umane con crioconservazione ottimizzata

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November 3rd, 2023

DOI :

10.3791/200824-v

November 3rd, 2023

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Xinyue Bai*¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Ting Zhang*¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xinyue Zhu¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xianyu Huang¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Haiyun Liu¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xiaoyan Ding⁸, Mei Jiang¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷, Xiaodong Sun¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷

¹Department of Ophthalmology, Shanghai General Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, ²National Clinical Research Center for Eye Diseases, ³Shanghai Clinical Research Center for Eye Diseases, ⁴Shanghai Key Clinical Specialty, ⁵Shanghai Key Laboratory of Ocular Fundus Diseases, ⁶Shanghai Engineering Center for Visual Science and Photomedicine, ⁷Shanghai Engineering Center for Precise Diagnosis and Treatment of Eye Diseases, ⁸Stem Cell Core Facility, CAS Center for Excellence in Molecular Cell Science, Chinese Academy of Sciences

* Questi autori hanno contribuito in egual misura

Trascrizione

Per iniziare, dissociare le cellule epiteliali pigmentate retiniche derivate da hESC, preparare la sospensione cellulare e quindi contare le cellule. A questo punto, centrifugare le celle a 250 g per tre minuti a temperatura ambiente. Versare il surnatante, quindi risospendere il pellet cellulare in mezzo di crioconservazione.

Quindi, trasferire un millilitro della sospensione cellulare in una fiala criogenica da 1,2 millilitri. Metti le fiale criogeniche in un contenitore di congelamento e congelale per una notte a meno 80 gradi Celsius. Trasferire le fiale in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.

Per scongelare le fiale congelate, riscaldare prima il terreno di coltura in perle metalliche riscaldate a 37 gradi Celsius, pre-riempire 10 millilitri del terreno di coltura riscaldato in una provetta da 15 millilitri. Ora, rimuovi le fiale criogeniche dall'azoto liquido e mettile in un sistema di scongelamento automatizzato per uno scongelamento rapido. Far cadere da 0,5 a un millilitro del terreno di coltura preriscaldato nella fiala criogenica per garantire un adattamento graduale delle cellule.

Quindi, pipettare da 1,5 a due millilitri della sospensione cellulare nella provetta da 15 millilitri con terreno. Centrifugare le celle a 250 g per tre minuti a temperatura ambiente. Quindi, scartare il surnatante.

Risospendere il pellet in due millilitri di terreno caldo. Caricare le cellule in un emocitometro e contarle per determinare i tassi di recupero e sopravvivenza. Coltura delle cellule scongelate su piastre rivestite con membrana basale in un terreno di coltura con Y27632.

Le cellule epiteliali pigmentate retiniche che sono state congelate il quinto giorno nella loro fase esponenziale hanno mostrato un tasso di attaccamento più elevato dopo lo scongelamento. Rispetto alla loro caratteristica morfologia esagonale, le cellule congelate in altri punti temporali avevano un fenotipo fibroblastico. Le cellule P2 del quinto giorno hanno mostrato un'espressione più elevata e marcatori cellulari localizzati più correttamente 28 giorni dopo lo scongelamento.

È stato notato che diversi terreni di crioconservazione hanno ottenuto risultati altrettanto buoni nel raggiungere un'elevata vitalità cellulare e attaccamento dopo lo scongelamento.

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