Per iniziare, rivestire una piastra a micropozzetti con 150 microlitri di soluzione di attacco cellulare dallo 0,01% allo 0,1% prima dell'incubazione. Una volta che il piatto si è asciugato all'aria, aggiungere 80 microlitri di soluzione di nanoparticelle d'oro goccia a goccia sulla superficie asciutta. Il giorno successivo, rimuovere l'eventuale terreno di coltura aggiunto dal micropozzetto.
Quindi aggiungere due millilitri di cellule trasfettate sopra le nanoparticelle d'oro immobilizzate sulla superficie del vetro. Incubare la piastra prima dell'inizio della sperimentazione. Utilizzare un microscopio confocale con un laser d'organo impostato a 488 nanometri per visualizzare la fluorescenza GFP dalla proteina annessina.
Imposta il laser al neon ad elio a 633 nanometri per osservare la riflessione delle nanoparticelle d'oro. Scegliere cellule singole invece di cluster di cellule per evitare la sovrapposizione delle membrane plasmatiche. Assicurarsi che le nanoparticelle d'oro immobilizzate siano presenti come particelle singole e adeguatamente distanziate per evitare un aumento del gradiente termico.
Usa la pinzetta ottica per irradiare la nanoparticella d'oro per un secondo per distruggere la membrana plasmatica. Per generare vescicole unilamellari giganti o GUV, applicare 90 microlitri di gel PVA riscaldato al 5% su un vetrino. Distribuire uniformemente il gel sul vetrino.
Quindi lasciare asciugare il vetrino in un armadio riscaldante a 50 gradi Celsius per 50 minuti. Successivamente, utilizzare una siringa di vetro per applicare 30 microlitri di miscela lipidica. Con il bordo dell'ago, stendere il composto in una pellicola sottile.
Applicare un leggero flusso di azoto gassoso per far evaporare il cloroformio della miscela lipidica. Quindi asciugare i vetrini sotto vuoto per 1,5-2 ore. In un tubo separato da due millilitri, aggiungi 400 microlitri di tampone di crescita.
Quindi aggiungere la proteina ricombinante di interesse a una concentrazione finale di 500 nano molari. Pipettare 400 microlitri di proteina diluita nella camera interna assemblata e avvolgere la camera in PERIFIL. Dopo un'incubazione di un'ora, trasferire 400 microlitri del contenuto della camera in una provetta da due millilitri.
Aggiungere un millilitro di tampone di osservazione nella soluzione raccolta per rimuovere eventuali proteine non incapsulate. Quindi centrifugare la soluzione a 600 G per 10 minuti a 13 gradi Celsius. Successivamente, sostituire un millilitro di surnatante con un tampone di osservazione e pipettare delicatamente per disperdere i GUV.
Conservare in frigorifero fino all'inizio della sperimentazione. Per forare il GUV, rivestire prima la superficie di un piatto di fondo in vetro da 35 millimetri con beta caseina. Successivamente, aggiungi 5 microlitri di nano gusci d'oro a 150 nanometri alla miscela GUV contenente cloruro di calcio.
Trasferire la miscela nella camera e montarla sul tavolino del microscopio. Usa le pinzette ottiche per intrappolare un singolo guscio nano d'oro sulla superficie del GUV. Quando il guscio nano intrappolato è a stretto contatto con la membrana GUV, aumentare la potenza del laser per perforare il sito bersaglio.
L'irradiazione di nanoparticelle ha provocato una lesione della membrana e ha causato un rapido reclutamento di annessine nel sito della lesione, in seguito all'afflusso di calcio per formare una struttura ad anello. Negli esperimenti GUV, la puntura della membrana è stata rapidamente risigillata in assenza di annessine. Le caratteristiche biofisiche uniche della proteina annessina A 4 hanno portato allo scoppio del GUV a causa della sua capacità di arrotolare le membrane.
La presenza di annessina nei GUV ha causato un rapido accumulo nel sito della lesione, in seguito alla puntura della membrana. L'analisi degli anelli di annessina A 5 negli esperimenti cellulari ha mostrato che sono rimasti costanti nel tempo e nello spazio. La rottura della membrana plasmatica mediante termoplasmonica ha causato livelli elevati di ioni calcio.
Le cellule hanno raggiunto un'intensità massima di calcio a 6,6 secondi, un tempo che si presume corrisponda al momento della chiusura della ferita.
