Per iniziare, prelevare 10 millilitri di campione di acqua di diatomee in una provetta da centrifuga. Centrifugare la provetta a 13.400 g per cinque minuti. Con una pistola a pipetta, scartare con cura 9,8 millilitri di surnatante.
Quindi trasferire 200 microlitri del campione di acqua di diatomee arricchita in una provetta da centrifuga da due millilitri. Successivamente, prelevare 0,5 grammi di tessuto del margine polmonare da un corpo umano annegato. Con le forbici, taglia il tessuto polmonare fino a quando non diventa fangoso.
Per l'estrazione del DNA da campioni di diatomee e polmoni, aggiungere prima le perle di vetro a entrambi i campioni. Dopo aver mescolato bene i campioni, aggiungere 40 microlitri di proteinasi K alle provette. Dopo un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente, aggiungere 200 microlitri di tampone legante in entrambe le provette.
Mescolare immediatamente i campioni con un miscelatore a vortice per quattro minuti. Quindi mettere i tubi a bagnomaria a 70 gradi Celsius per 10 minuti. fino a quando la soluzione non diventa chiara.
Successivamente, trasferire la soluzione limpida con precipitato flocculante. in una colonna di adsorbimento lunga tre centimetri impacchettata con matrice di silicio. Centrifugare la colonna a 8.000 g per 30 secondi.
Quindi gettare il liquido di scarto nella provetta di raccolta e reinserire la colonna nella provetta di raccolta. Aggiungere ora 500 microlitri di tampone di rimozione dell'inibitore nella colonna e centrifugare a 13, 400 G per 30 secondi. Dopo aver eliminato il liquido di scarto, aggiungere 700 microlitri di tampone di lavaggio alla colonna e centrifugare nuovamente.
Dopo aver eliminato il liquido di scarto, riposizionare la colonna di adsorbimento nella provetta di raccolta vuota. Centrifugare la colonna a 14.500 g per due minuti per rimuovere la maggior quantità possibile di tampone di lavaggio. Ora estrai la colonna e mettila in una provetta da centrifuga pulita.
Aggiungere 100 microlitri di tampone di eluizione alla parte centrale della membrana di adsorbimento. Centrifugare la colonna a 13.400 g per un minuto dopo un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente. Trasferire nuovamente la soluzione ottenuta nella provetta di raccolta nella colonna di adsorbimento prima di centrifugare nuovamente.
Conservare il DNA della diatomea eluito a una temperatura compresa tra due e otto gradi Celsius per un uso futuro. L'elettroforesi su gel di agarosio ha mostrato bande di DNA di diatomee tra 250 e 500 BP sia nei campioni d'acqua che nei tessuti dopo l'amplificazione PCR.
