Per iniziare, preriscaldare le teste di zanzara anofele sezionate in tampone CCD a 37 gradi Celsius su un blocco termico per cinque minuti. Trasferire il tubo con le teste di zanzara in un forno di ibridazione per la rotazione a 37 gradi Celsius. Quindi, trasferisci l'intero contenuto del tubo in un vetro da orologio da dissezione.
Con una pinza, prelevare le teste o eventuali antenne staccate e fissarle in un millilitro di prefissativo. In un nutator, ruotare le teste nel prefissativo per 24 ore a quattro gradi Celsius. Per eseguire la dissezione dei tessuti, per prima cosa, sciacquare le testine con un millilitro di PBS-Tween allo 0,1% su ghiaccio.
Quindi trasferisci le teste in un vetro da sezione. Sotto un microscopio da dissezione, rimuovere i tessuti di interesse dalla testa con una pinza affilata. Tenere la parte anteriore della testa con la pinza e afferrare un'antenna con un'altra pinza dalla base.
Allo stesso modo, rimuovere i palpi. Trasferire le antenne e i palpi in provette vuote prive di DNA/RNA poste su ghiaccio. Disidratare il tessuto in 400 microlitri di reagente disidratante per un'ora a temperatura ambiente.
Quindi sostituire il reagente disidratante con 400 microlitri di metanolo assoluto e disidratare i tessuti durante la notte a meno 20 gradi Celsius. Al termine della fissazione, reidratare i tessuti in una serie di soluzioni di reidratazione graduata in quattro fasi per 10 minuti sul ghiaccio. Quindi lavare i fazzoletti in 400 microlitri di PBST per 10 minuti a temperatura ambiente.
Incubare i tessuti in 400 microlitri di soluzione di proteinasi K per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare i fazzoletti due volte in 400 microlitri di PBST per arrestare la digestione enzimatica. Dopo l'aggiunta del post-fissativo, lavare nuovamente il tessuto con PBST prima dell'ibridazione della sonda.
Immergere il tessuto in 400 microlitri di tampone di ibridazione della sonda per cinque minuti. Successivamente, rimuovere il tampone e pre-ibridare il tessuto in 400 microlitri di tampone di ibridazione della sonda preriscaldato per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Sostituire il tampone di ibridazione della sonda preriscaldata con 400 microlitri di soluzione della sonda riscaldata.
Metti il tubo in un nutator per due notti a 37 gradi Celsius. Quindi posizionare il nutator all'interno di un'incubatrice coperta da una scatola. Successivamente, nutare il tessuto in 400 microlitri di tampone di lavaggio della sonda a 37 gradi Celsius nell'incubatrice.
Dopo aver lavato i tessuti in 5x SSCT, incubare in 400 microlitri di tampone di amplificazione per 10 minuti a temperatura ambiente. Pipettare il tampone di amplificazione dal tubo. Quindi aggiungere una miscela delle forcine riscaldate, H1 e H2. Successivamente, pipettare 100 microlitri di tampone di amplificazione.
Nutare il tessuto per una notte al buio a temperatura ambiente. Per montare il tessuto, posizionare prima cinque gocce di soluzione di montaggio su un vetrino. Successivamente, con una pinza, afferra i campioni di tessuto lavati dalla loro base.
Immergere e risciacquare delicatamente nella serie di goccioline di soluzione di montaggio. Quindi montare con la soluzione di montaggio e posizionare un vetrino coprioggetto sul tessuto. Sigillare il vetrino coprioggetto con smalto per unghie prima dell'imaging.
Le analisi HCR del tessuto olfattivo della zanzara anofele femmina hanno rivelato che IR 41t1, IR75d e IR7t erano meno abbondanti nelle antenne. IR64a era tre volte più abbondante rispetto al resto dei geni candidati. La co-localizzazione delle famiglie di recettori orco e IR25a è stata osservata nell'antenna e nel palpo mascellare della zanzara.
I modelli di co-localizzazione suggeriscono che le cellule IR76b positive esprimono IR25a, mentre le cellule IR8a positive co-localizzano parzialmente con IR76b e IR25a.
