Per iniziare, rimuovere l'omento umano appena asportato dal contenitore di raccolta all'interno di una cappa a flusso laminare. Immergere l'omento in PBS per lavare delicatamente via eventuali residui di sangue o detriti. Usando un bisturi e una pinza, taglia il tessuto a pezzi.
Posizionare i pezzi di omento in singoli pozzetti di una piastra di coltura a 24 pozzetti. Quindi riempire i pozzetti con 500 microlitri di terreno di coltura dell'omento. Aggiungere 10 millilitri di PBS sterile a un matraccio di coltura contenente il 75% di cellule di carcinoma ovarico umano mCherry positive confluenti.
Scuotere delicatamente il pallone per lavare le cellule. Rimuovere il PBS e aggiungere tre millilitri di EDTA allo 0,05% di tripsina. Scuotere di nuovo delicatamente il pallone di coltura per distribuire uniformemente la tripsina EDTA sulle cellule attaccate.
Quindi mettere il pallone in un'incubatrice per cinque minuti a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Dopodiché, rimuovere il pallone dall'incubatrice. Ora picchiettare il pallone di coltura per staccare completamente le cellule.
Quindi aggiungere tre millilitri di terreno di coltura dell'omento per neutralizzare la tripsina. Pipettare più volte la sospensione cellulare per mescolarla bene. Trasferire la sospensione in un tubo conico da 15 millilitri.
Centrifugare la sospensione a 1.200 g per cinque minuti a 24 gradi Celsius. Ora pipettare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in sei millilitri di terreno di coltura di omento fresco. Prelevare 10 microlitri di sospensione cellulare per contare le cellule utilizzando un contatore di cellule.
Diluire la sospensione cellulare con terreni di coltura freschi fino alla densità richiesta. Con una siringa da un millilitro, aspirare la sospensione delle cellule tumorali. Inserire un ago calibro 26 nella siringa.
Ora usa un paio di piccole pinze chirurgiche per prelevare un pezzo di omento tagliato e posiziona il pezzo di omento in un piatto sterile separato. Quindi iniettare circa 100 microlitri di sospensione di cellule tumorali nel tessuto. In alternativa, miscelare volumi uguali di matrice di membrana basale scongelata con coltura di omento.
Mettere la miscela sul ghiaccio fino all'iniezione. Dopo aver immerso i pezzi di omento nella miscela di matrice nei pozzetti della piastra di coltura, incubare la piastra per 20 minuti. Successivamente, rimuovere la piastra dall'incubatrice.
Una volta che la miscela si è solidificata, iniettare i pezzi di omento con le cellule tumorali. Confermare l'avvenuta iniezione delle cellule tumorali utilizzando l'imaging fluorescente. Una striscia di segnale fluorescente può essere vista nei siti di iniezione come conferma.
Per facilitare la co-coltura dell'omento e delle cellule tumorali, aggiungere da 500 a 200 microlitri di terreno fresco ogni 48-72 ore. Infine, utilizzando un microscopio a fluorescenza, monitorare la crescita dei tumori del cancro ovarico. La crescita del tumore può essere visibile in due settimane.
Le cellule tumorali ovariche sono state integrate con successo nei pezzi di omento entro il giorno 14. Le cellule tumorali inizialmente si diffondono sulla superficie dell'omento nella prima settimana. Nel corso del tempo, le cellule si sono raggruppate per formare tumori.
Il carico tumorale è stato confermato dal cambiamento di colore dell'omento medio, che è passato dal rosso al giallo.
