Per iniziare, aggiungere 500 microlitri di gel di coltura caldo in un pozzetto in una piastra da 24 pozzetti. Trasferire rapidamente gli incisivi interi sezionati isolati dal topo nel pozzetto. Agitare la piastra un paio di volte per sciacquare gli incisivi.
Aggiungere 400 microlitri di gel di coltura caldo in una piastra di coltura e trasferire gli incisivi risciacquati nella capsa. Orientare l'incisivo per posizionare la regione dell'ansa cervicale al centro della piastra e regolare l'inclinazione dell'incisivo apicale per il piano di imaging desiderato. Una volta che il gel è fissato, utilizzando un paio di pinze sottili, rimuovere il gel sopra la regione di interesse.
Aggiungere circa 150 microlitri di terreno di coltura caldo contro il bordo della piastra per coprire il campione. Posizionare la coltura di espianto a 37 gradi Celsius per consentire al tessuto di assestarsi. Dopo un'ora, accendere il microscopio e il laser a due fotoni.
Fissare la piastra di coltura all'adattatore del tavolino e posizionare l'anello adattatore a profusione sulla parte superiore. Collegare l'adattatore del tavolino a un regolatore di temperatura per mantenere la coltura a 37 gradi Celsius. Collegare l'ingresso e l'uscita dell'anello adattatore a una pompa a microprofusione.
Impostare la velocità di profusione su 20 e avviare la profusione del terreno sul campione. Posizionare un ACBR sopra l'anello adattatore e sollevare il tavolino in modo che l'obiettivo si adatti all'ACBR per entrare in contatto con il terreno di coltura. Ruotare la lunghezza d'onda del laser a 920 nanometri per visualizzare la GFP.
Dopo aver individuato il campione attraverso un oculare, visualizzarlo con un software per microscopio, quindi impostare la dimensione del passo Z di quattro micrometri e un intervallo di tempo di cinque minuti per 14 ore. Avviare l'imaging time-lapse e salvare i file successivi per l'analisi dei dati a valle. Nella microscopia time-lapse del K14-Cre; R26-rtTA; tetO-H2B-GFP loop cervicale, i segnali H2B-GFP sono stati osservati prevalentemente nella regione trans-amplificante del loop cervicale, indicando divisioni cellulari attive.
Inoltre, è stata osservata la condensazione e l'allineamento dei cromosomi alla piastra di metafase nelle cellule mitotiche seguita dalla loro segregazione durante l'anafase e in due cellule figlie. La maggior parte delle divisioni cellulari erano perpendicolari o ad un angolo obliquo rispetto alla membrana basale con meno divisioni orizzontali parallele alla membrana basale. Eventi di divisione cellulare erano evidenti anche in K14-Cre; Anse cervicali R26-mT/mG in cui tutte le membrane cellulari epiteliali sono state etichettate in verde.
Le cellule mitotiche sono state identificate dal loro arrotondamento cellulare e dalla successiva citochinesi. In K14-Cre; Sono state osservate anche anse cervicali R26-mT/mG, divisioni cellulari sia orizzontali che verticali.
