Per sviluppare un metodo LC-TIMS ToF MS/MS per l'analisi di peptidi istonici proteolitici, accoppiare un HPLC dotato di una colonna C-18 con uno strumento commerciale TIMS ToF MS con tecnologia passiva proprietaria. Quindi, impostare le condizioni operative di ionizzazione nanoelectrospray su 4, tensione capillare di 500 volt, offset della piastra terminale di 800 volt, pressione del nebulizzatore a tre bar, gas secco di 10 litri al minuto e riscaldatore a secco di 200 gradi Celsius. Configurare le impostazioni MS su un'energia di collisione di sei elettronvolt, una RF di collisione di 1200 VPP, un tempo di trasferimento di 75 microsecondi e una memorizzazione di cinque microsecondi prima dell'impulso.
Regolare il volume di iniezione a 20 microlitri, corrispondenti a otto microgrammi del campione, e impostare la portata a 0,4 millilitri al minuto. Dopo aver immesso la sequenza temporale del gradiente specificata e la prova dell'acetonide con percentuali di acido formico dello 0,1%, selezionare OK in entrambe le finestre pop-up per salvare il metodo. Eseguire un gradiente LC non lineare di 60 minuti utilizzando acqua e acetonitrile, entrambi con acido formico allo 0,1%.
Verificare l'eluizione del campione dall'HPLC nel TIMS ToF tramite ionizzazione nanoelettrospray in modalità di ionizzazione positiva. Per identificare le sequenze peptidiche e i siti di modifica con lo strumento MS-Digest, generare un elenco teorico di peptidi utilizzando Protein Prospector. Quindi, eseguire una digestione teorica considerando le condizioni di digestione, il tipo di modifiche post-traduzionali, l'intervallo di dimensioni dei peptidi, l'intervallo di rilevamento della massa e il numero potenziale di scissioni mancate.
Per analizzare i dati acquisiti, cercare le masse a diversi stati di carica, che vanno da più uno a più quattro, per ogni peptide teorico. Dopo aver identificato ogni rapporto massa/carica, selezionare il picco e confermare l'MSMS utilizzando un elenco teorico di ioni di frammentazione basato sulla sequenza peptidica. Comprese le modifiche post-traduzionali.
Gli spettri di frammentazione dei peptidi hanno rivelato tre diverse varianti peptidiche con varie modificazioni post-trascrizionali, tra cui i gruppi propionile e acetilico, in posizioni diverse. Lo standard dell'istone propionilato H3 ha mostrato peptidi più lunghi rispetto alla versione non modificata. Gli istoni estratti dalle cellule HeLa S3 hanno mostrato più modelli di modificazione post-traduzionale nelle stesse posizioni degli amminoacidi.
