Per iniziare, rimuovere il tessuto dalle ossa del topo sezionato sottoposto a eutanasia. Mettere le ossa pulite in una nuova piastra a sei pozzetti contenente tampone FACS posta su ghiaccio. Trasferire le ossa in un mortaio con da due a cinque millilitri di tampone FACS.
Macinare le ossa con un movimento circolare fino a quando il midollo osseo non viene rilasciato. Con una siringa da tre millilitri, tirare verso l'alto e sciacquare il midollo osseo per omogeneizzarlo. Estrarre l'omogenato in un'altra siringa, quindi filtrarlo attraverso un colino cellulare da 70 micrometri in un tubo da 50 millilitri.
Sciacquare i pezzi di tessuto dal filtro nella malta con tampone FACS prima di omogeneizzare una seconda volta. Filtrare il futile risciacquato come prima. Successivamente, sciacquare le spicole ossee rimanenti nel mortaio con tampone FACS.
Quindi sciacquare i pezzi in un tubo da 15 millilitri per garantire la massima resa. Per digerire il midollo osseo, centrifugarlo prima a 300 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Risospendere il pellet di midollo osseo in due millilitri di miscela per la digestione.
Trasferire il composto in un tubo da 15 millilitri. Quindi incubarlo a 37 gradi Celsius per 45 minuti su un rotatore. Ora, aggiungi 10 millilitri di tampone FACS per fermare la digestione enzimatica.
Filtrare la miscela attraverso un colino cellulare da 70 micrometri in un tubo da 50 millilitri. Centrifugare la sospensione a 400 g per sette minuti a quattro gradi Celsius. Risospendere il pellet in un millilitro di tampone di lisi dei globuli rossi.
Successivamente, aggiungere 10 millilitri di tampone FACS per arrestare la lisi. Quindi filtrare la miscela come prima in un tubo da 50 millilitri. Infine, centrifugare il composto a 300 g per cinque minuti a quattro gradi centigradi.
Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet in 100 microlitri di tampone FACS. Per la digestione delle spicole ossee, per prima cosa, fai vorticare le spicole ossee. Decantare il surnatante e trattenere le ossa sul fondo.
Quindi, risospendere le spicole in un millilitro della miscela per la digestione delle spicole ossee. Incubare il tubo su un rotatore per 60 minuti a 37 gradi Celsius. Infine, arrestare la digestione con 10 millilitri di tampone FACS.
Filtrare la miscela nella provetta da 50 millilitri contenente il midollo osseo lisata e digerito dai globuli rossi.
