Per iniziare, mescolare la sospensione isolata del midollo osseo murino con la sospensione della spicola ossea. Pipettare 10 microlitri della sospensione cellulare su un emocitometro per il conteggio. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius.
Quindi risospendere il pellet in 100 microlitri di tampone FACS. Per colorare le cellule con anticorpi per la deplezione magnetica, aggiungere il blocco FC, l'APC CD45 e l'APC TER-119. Quindi lavare la sospensione cellulare con tampone FACS.
Dopo aver centrifugato la miscela rimanente, risospendere il pellet in 100 microlitri di tampone FACS. Per colorare la sospensione cellulare con microsfere per la deplezione magnetica, aggiungere IgG di topo e microsfere anti-APC. Incubare la miscela su ghiaccio per 20 minuti.
Lavare la colonna LD con due millilitri di tampone MACS. Risospendere le cellule nel tampone, quindi filtrarle attraverso una provetta da cinque millilitri con un tappo del filtro cellulare da 35 micrometri. Quindi, posizionare la colonna LD sul supporto del separatore magnetico e posizionare una provetta da cinque millilitri sotto la colonna per raccogliere il materiale eluito.
Pipettare la sospensione cellulare nella colonna LD e raccogliere il flusso della frazione negativa nella provetta. Lavare la colonna due volte con un millilitro di tampone MACS e raccogliere il materiale eluente nella stessa provetta. Posizionare la colonna LD su una nuova provetta da cinque millilitri.
Con una pipetta, erogare tre millilitri di tampone nella colonna, quindi sciacquare le cellule marcate positivamente in una provetta da cinque millilitri. Centrifugare sia la frazione positiva che quella negativa, quindi risospendere il pellet in 100 microlitri di tampone FACS. Per colorare la frazione negativa CD45 TER-119 aggiungere un microlitro di ciascun anticorpo ogni 10 alla sesta cellula.
Mettere la sospensione sul ghiaccio per 20 minuti. Quindi lavare la sospensione con due millilitri di tampone FACS prima della centrifugazione. Aggiungere un millilitro di tampone al pellet e pipettare ioduro di propidio per la colorazione delle cellule vive.
Infine, filtrare il campione attraverso un filtro cellulare da 35 micrometri in una provetta da cinque millilitri prima di analizzare le cellule su un citometro a flusso multicolore. Le cellule endoteliali arteriolari si sono espanse significativamente nel microambiente della leucemia mieloide acuta con una concomitante perdita nelle popolazioni endoteliali sinusoidali. Una piccola espansione nelle cellule stromali mesenchimali è stata osservata a otto settimane di età.
