Per iniziare, aggiungi otto millilitri di DPBS in una provetta conica sterile da 50 millilitri. A questo, aggiungi otto millilitri di sangue e usa una pipetta Pasteur di plastica da tre millilitri per mescolare bene il contenuto. Aggiungere 15 millilitri di terreno di isolamento linfocitario in un'altra provetta conica.
Inclinare il tubo da 20 a 30 gradi. Quindi utilizzare una pipetta Pasteur da tre millilitri per applicare delicatamente il primo strato della miscela di DPBS di sangue sul terreno di isolamento. Stratificare con cura la miscela rimanente sulla parete laterale del tubo.
Portare lentamente la provetta in posizione verticale per stratificare il sangue rimanente sullo strato sanguigno. Centrifugare la provetta a 1000 G per 10 minuti a temperatura ambiente in un secchio oscillante con i freni disattivati. La miscela di PBMC nel sangue si separerà in quattro strati distinti.
Con una pipetta Pasteur, rimuovere due terzi dello strato di plasma, quindi utilizzare una pipetta da un millilitro per raccogliere le PBMC. Trasferire le PBMC in una nuova provetta da 50 millilitri fino a quando l'intero strato non è stato raccolto. Quindi aumentare il volume fino a 25 millilitri con DPBS per rimuovere il mezzo di isolamento residuo e altri residui.
Centrifugare la provetta a 100G per 10 minuti a temperatura ambiente con i freni tirati. Quindi rimuovere il surnatante con una pompa a vuoto. Quindi, risospendere il pellet in un millilitro di DPBS e aggiungere più DPBS per compensare il volume a 25 millilitri per lavare e risospendere il pellet.
Raffreddare un contenitore per congelare a quattro gradi Celsius. Quindi mettere il siero fetale bovino sul ghiaccio. Risospendere il pellet cellulare contenente le PBMC isolate in un millilitro di siero fetale bovino.
Successivamente, ho mescolato il DMSO con il siero raffreddato su ghiaccio in un rapporto di uno a cinque. Trasferire la sospensione cellulare in criotubi marcati da due millilitri, utilizzando una provetta per provetta di raccolta. Con un contatore di cellule automatizzato, è possibile determinare il numero di cellule e la vitalità.
Utilizzare una pipetta da un millilitro per far cadere un millilitro della miscela DMSOFBS nella provetta. Quindi mettere i tubi nel contenitore di congelamento preraffreddato. Metti il contenitore in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per 24 ore.
Il giorno successivo, rimuovere i tubi dal congelatore e conservarli nella fase gassosa di azoto liquido. La conta cellulare e la vitalità erano coerenti prima e dopo la crioconservazione, indicando un isolamento e una conservazione di successo.
