Per iniziare, sciacquare le larve di Drosophila allo stadio L3 tre volte per cinque minuti ciascuna in PBS freddo. Usando due paia di pinze affilate, tenere la parte anteriore delle larve e rimuovere circa 2/3 dei tessuti del corpo. Tenere il primo 1/3 delle larve con un paio di pinze e gli uncini per la bocca con l'altro paio.
Quindi ritrarre i ganci della bocca all'interno delle larve fino a quando le larve non sono completamente invertite. Rimuovere i dischi delle zampe e il cervello per ottenere una carcassa larvale rovesciata pulita con un paio di dischi alari attaccati alla trachea. Trasferire i dischi alari in una provetta da centrifuga da un millilitro.
Fissare i dischi alari in paraformaldeide al 4% diluita in PBS per 45 minuti a temperatura ambiente sotto agitazione. Dopo il fissaggio, lavare i campioni tre volte per cinque minuti ciascuno con etanolo al 70%. Rimuovere le teste, gli addomi, le zampe e le ali dalle mosche anestetizzate e posizionare i toraci sezionati in PBS freddo.
Prefissare il torace in paraformaldeide al 4% diluita in Tritone all'1% per 20 minuti sotto agitazione. Quindi lavare i campioni tre volte per cinque minuti ciascuno utilizzando PBT sotto agitazione. Posizionare i torace su un nastro biadesivo su un vetrino e dividerli in due utilizzando una lama affilata per microtomo per produrre due emitorace.
Fissare gli emitorace in paraformaldeide al 4% per 45 minuti sotto agitazione. Lavare i campioni due volte per 20 minuti ciascuno utilizzando PBT sotto agitazione. Posizionare gli emitorace in PBS freddo e utilizzare le pinze per isolare con cura i muscoli del volo indiretto dagli emitoraci.
Permeabilizzare i muscoli in etanolo al 70% per due o sette giorni a quattro gradi Celsius. Dopo la permeabilizzazione, lavare gli IFM due volte per 20 minuti ciascuno utilizzando il tampone A.Quindi aggiungere 400 microlitri del tampone di ibridazione e pre-ibridare i muscoli per 30 minuti a 37 gradi Celsius in un miscelatore termico. Aggiungere 100 microlitri di tampone di ibridazione appena preparato contenente la sonda e l'anticorpo primario.
Incubare i campioni al buio a 37 gradi Celsius per 16 ore a 300 giri/min in un miscelatore termico. Dopo l'incubazione, lavare i campioni tre volte utilizzando il tampone A caldo per 10 minuti ciascuno. Quindi incubare i campioni in anticorpo secondario e DAPI diluiti nel tampone A a 37 gradi Celsius per un'ora.
Lavare i campioni tre volte con il tampone B per 20 minuti ciascuno prima di trasferirli su un vetrino da microscopio. Rimuovere il tampone residuo B e aggiungere 30 microlitri di mezzo di montaggio sul vetrino. Posiziona un vetrino coprioggetto di 18 x 18 millimetri sul vetrino e sigillalo con lo smalto.
