Dopo aver acceso il microscopio confocale dotato di obiettivi a immersione in olio 40x e 63x, posizionare il vetrino sul tavolino del microscopio. Per visualizzare i progenitori muscolari associati al disco alare e i muscoli del volo indiretto o IFM, impostare DAPI con un'eccitazione di 405 e un'emissione di 450 nanometri. Quindi seleziona Alexa Fluor 488 con un'eccitazione di 496 ed emissione di 519 nanometri, e Quasar 670 per le sonde smFISH con un'eccitazione di 647 ed emissione di 670 nanometri.
Localizzare il campione utilizzando un segnale DAPI e una lampada UV. Salvare le immagini acquisite come file TIFF. Per visualizzare le cellule staminali muscolari adulte, impostare le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione per DAPI e Alexa Fluor 488 come dimostrato in precedenza.
Quindi impostare le lunghezze d'onda per Alexa Fluor 555 e Quasar 670 per le sonde smFISH. Individua il campione e salva le immagini acquisite in formato TIFF. Avvia l'immagine J e vai al menu dei plugin.
Selezionare Macro, quindi Modifica per aprire il codice sorgente delle macro. Per quantificare le macchie di Mef2 smFISH nelle larve, impostare il raggio del log su tre e la qualità del log su 20. Quindi segmentare i nuclei positivi Mef2 con una sfocatura di due, un parametro di scala del nucleo di 30, una soglia del nucleo di meno otto e una dimensione del nucleo di 300.
Avviare la macro eseguendo il comando run. La macro caricherà automaticamente tutte le immagini dalla cartella designata e le quantificherà in sequenza. Nelle fibre muscolari, impostare il raggio logaritmico su 2,5, la qualità logaritmica su 60, la sfocatura su due, il parametro scala nucleo su 100, la soglia nucleo su zero e la dimensione nucleo su 300.
Avviare la macro eseguendo il comando run. La macro caricherà automaticamente tutte le immagini dalla cartella designata e le quantificherà in sequenza. Dopo l'analisi, controllare i risultati visualizzati nei risultati del file FISH e nei risultati dei nuclei del file.
I trascritti Mef2 e Zfh1 sono stati rilevati uniformemente nella popolazione AMP e colocalizzati rispettivamente con le proteine Mef2 e Zfh1. Un maggiore ingrandimento degli AMP ha distinto tra i focolai dei siti di trascrizione e l'mRNA maturo sparso nel citoplasma. Allo stesso modo, il sito di trascrizione e la distribuzione dell'mRNA Mef2 e Zfh1 sono stati esaminati in IFM adulti differenziati e cellule staminali associate.
L'immagine J macro costruita internamente ha rilevato e segmentato efficacemente i punti Mef2 e i nuclei muscolari. L'analisi quantitativa dell'mRNA Mef2 per nucleo negli IFM adulti e negli AMP non è risultata significativamente diversa. La quantificazione della distribuzione spot di Mef2 ha mostrato che il 92% dell'mRNA di Mef2 è presente nel citoplasma e l'8% è associato ai nuclei muscolari.
