Per iniziare, impostare i parametri della stazione pipetta posta nella cappa a flusso laminare a 1.900 volt, 20 millisecondi in un impulso. Rimuovere con cautela una provetta di trasfezione dalla confezione per mantenerla sterile e riempirla con tre millilitri di tampone E. Per preparare le cellule all'elettroporazione, rimuovere il terreno di coltura dalle cellule e lavarle utilizzando PBS per rimuovere il siero e i cationi bivalenti che promuovono l'adesione.
Quindi aggiungere una miscela di PBS e un millimolare di EDTA alle cellule e incubare a temperatura ambiente per circa cinque minuti fino a quando le cellule iniziano a staccarsi. Pipettare delicatamente su e giù per staccare le cellule e trasferirle in una provetta da 15 millilitri a basso legame proteico. Pellettare le cellule a 500 G per cinque minuti.
Dopo la centrifugazione, rimuovere rapidamente la maggior parte del surnatante, lasciando circa un millilitro del surnatante nella provetta. Risospendere le cellule nel surnatante rimanente e trasferirlo in una provetta microfuge da 1,5 millilitri a basso legame proteico. Prelevare una piccola aliquota di cellule per contare e pellettare le cellule rimanenti mediante centrifusione a 500 G a temperatura ambiente per cinque minuti.
Contare le cellule durante la centrifugazione. Prendere 1x sgRNA in una soluzione Cas9 da 20 millimolari e riscaldare le provette a temperatura ambiente. Dopo la centrifugazione, rimuovere tutto il surnatante dal pellet cellulare e risospendere le cellule in PBS con cloruro di calcio e cloruro di magnesio a una concentrazione di 40 milioni di cellule per millilitro.
Per l'assemblaggio del complesso ribonucleoproteico sgRNA Cas9, aggiungere 2,5 microlitri di sgRNA a un microlitro di Cas9 diluito in provette PCR sterilizzate ed erogare lentamente l'sgRNA mescolando per circa 15 secondi per prevenire la precipitazione. Incubare per cinque minuti a temperatura ambiente per consentire la formazione del complesso ribonucleoproteico. Per erogare il complesso ribonucleoproteico mediante elettroporazione, preparare la punta dell'elettroporazione premendo lo stantuffo per estendere lo stelo.
Quindi inserire il gambo nella punta. Risospendere le cellule pipettando su e giù. Caricare la punta per elettroporazione con le celle ed estrarre l'intera capacità volumetrica di 10 microlitri della punta.
Partendo dall'sgRNA di controllo negativo, trasferire 10 microlitri di cellule nella punta dell'elettroporazione nella provetta contenente 3,5 microlitri di ribonucleoproteina. Pipettare su e giù tre volte per mescolare bene e aspirare 10 microlitri di miscela nel puntale. Posizionare la punta nella stazione di elettroporazione, abbassandola nel tampone, e premere Start sul display touchscreen.
Al termine, il display indicherà un impulso riuscito. Rimuovere la pipetta dal dispositivo e posizionare le cellule in un pozzetto asciutto della piastra a 12 pozzetti non rivestita. Sciacquare la punta pipettando su e giù due volte in 15 millilitri di PBS con cloruro di calcio e cloruro di magnesio.
Mettere da parte la pipetta con il puntale ancora attaccato. Aggiungere immediatamente un millilitro del terreno privo di antibiotici aliquotato in precedenza alle cellule e agitare delicatamente la piastra per mescolare. Il cromatogramma di sequenziamento Sanger rappresentativo del locus Rosa 26 dai macrofagi derivati dal midollo osseo elettroporati con una ribonucleoproteina controllata sgRNA Cas9 non mirata, sgRNA specifico Rosa 26 e geni Src e Cblb nei macrofagi modificati sono mostrati qui.
L'analisi dei geni bersaglio mediante PCR e sequenziamento Sanger mostra nucleotidi multipli in ogni posizione a valle del sito di scissione di Cas9. Questi risultati convalidano il raggiungimento di un'elevata efficienza di editing per più geni bersaglio.
