Per iniziare, utilizzare una siringa Hamilton da 25 microlitri per iniettare intraperitoneale cuccioli di ratto anestetizzati con 15 microlitri di Addgene. Successivamente, radere i capelli e i baffi dei cuccioli anestetizzati di sei-otto settimane. Montare il ratto su un telaio stereotassico con barre auricolari.
E posiziona un termoforo sotto per mantenere la temperatura corporea dell'animale. Successivo posto di garza immersa in soluzione salina ghiacciata sulla testa del ratto per ridurre al minimo il sanguinamento. Con un bisturi misura 15, praticare un'incisione sulla linea mediana della pelle e del muscolo sopra il cranio.
Tira via la pelle e il muscolo per esporre il cranio. Con una punta da trapano rotonda uno per quattro, perforare con cura la calotta cranica per esporre il prosencefalo. Quindi usa i rongeur per tagliare il cranio.
Con un bisturi misura 15, praticare un'incisione nel cervello e nel bulbo olfattivo. Usa una spatola per staccare con cautela la dura dal cranio. Quindi solleva delicatamente il cervello reciso per visualizzare il ganglio del trigemino e la base del cranio.
Cauterizzare qualsiasi sanguinamento con una penna per cauterizzazione. Per visualizzare l'immagine del GCaMP6-X, posizionare la cavità cranica sotto l'obiettivo del microscopio. Quindi metti a fuoco il ganglio terminale.
Successivamente, applica stimoli meccanici su un centimetro quadrato del viso. Usa un obiettivo 20X per visualizzare i neuroni del ganglio trigemino che rispondono allo stimolo. Per raccogliere lo stato fluorescente nel tempo con il software di acquisizione, premere il pulsante di acquisizione del flusso nel menu di acquisizione.
Quindi impostare il numero di fotogrammi su 300 e il tempo di acquisizione su 90 secondi. Impostare i parametri della fotocamera per acquisire le immagini alla frequenza dei fotogrammi. Ottieni registrazioni di base stabili nell'arco di tre minuti.
Un volume maggiore di titolo virale ha provocato un aumento dell'infezione neuronale dei cuccioli di ratto. La stimolazione meccanica leggera attivava solo la regione V2 del ganglio trigemino. La fluorescenza a riposo era relativamente bassa nella maggior parte dei neuroni, con pochi aumenti spontanei.
Gli stimoli naturali, in particolare la stimolazione punteggiata, hanno suscitato le risposte neuronali più robuste. Gli stimoli a spazzola nei modelli di lesione da costrizione cronica hanno suscitato un aumento di due volte dell'entità della risposta di picco sul lato ferito rispetto al lato controlaterale. Quando due stimoli sono stati applicati in serie, c'è stata un'amplificazione significativa in risposta al secondo stimolo.
