Per iniziare, isolare l'atrio sinistro e le vene polmonari o PV dal cuore del topo. Posizionare il tessuto isolato in un criomoldo con la base del cuore e l'apice polmonare rivolti verso l'alto. Srotolare e districare i PV nel caso in cui siano contorti.
Quindi, riempire il criomoldo con il composto OCT. Utilizzando una pinza fine, applicare una leggera compressione sui PV senza spostarli per rimuovere l'aria residua. Congelare il tessuto nel composto OCT su ghiaccio secco.
Per l'immunocolorazione, scongelare i vetrini PV di topo congelati su un sistema di colorazione per 20 minuti. Quindi somministrare diverse gocce di una soluzione fissatrice di paraformaldeide al 4% sulle sezioni per fissare il tessuto al vetrino. Dopo l'incubazione, spostare i vetrini su una griglia verticale e immergerli in un contenitore riempito di PBS.
Mettere il contenitore su uno shaker lento per cinque minuti per risciacquare i vetrini. Usando una penna bloccante liquida contenente xilolo, circondare ogni sezione su ogni vetrino. E riorganizzare i vetrini sul sistema di colorazione.
Utilizzando una pipetta Pasteur, applicare una o due gocce di soluzione di permeabilizzazione su ciascun campione. Quindi, pulire la soluzione Triton X-100 lavando i vetrini per cinque minuti in PBS. Dopo aver risistemato i vetrini sul sistema di colorazione, aggiungere una o due gocce di tampone bloccante a ciascuna sezione, garantendo una copertura completa.
Successivamente, preparare un millilitro della miscela di anticorpi primari costituita dagli anticorpi primari e dal tampone bloccante. Eliminare il buffer di blocco rimanente dalla diapositiva. Somministrare due o tre gocce della miscela di anticorpi primari a ciascuna sezione.
Dopo l'incubazione, posizionare i vetrini in una griglia verticale e sciacquarli per cinque minuti in tampone di lavaggio mantenendo una leggera agitazione. Quindi, preparare un millilitro della miscela di anticorpi secondari composta dagli anticorpi secondari e dal tampone di lavaggio. Riposizionare i vetrini sul sistema di colorazione e utilizzare una pipetta per erogare due o tre gocce della miscela di anticorpi secondari su ciascuna sezione.
Successivamente, pulire i vetrini tre volte per cinque minuti ciascuno in tampone di lavaggio mentre si agita. Successivamente, aggiungere due o tre gocce della soluzione Hoechst 33342 a ciascuna sezione disposta sul sistema di colorazione. Mettere i vetrini in una griglia verticale e sciacquarli per cinque minuti nel tampone di lavaggio agitando delicatamente.
Aggiungere una o due gocce di mezzo di montaggio fluorescente a ciascun vetrino e sigillare i vetrini con vetrini coprivetri. La regione dell'orifizio della vena polmonare nell'atrio sinistro e la giunzione della vena polmonare, le vene extrapolmonari e le vene interpolmonari sono state osservate con un ingrandimento 10X. Sono stati osservati segnali specifici di cTnT con una tipica striatura muscolare nell'orifizio della vena polmonare, nelle vene extrapolmonari e nelle vene intrapolmonari, con un ingrandimento di 40X.
Cx43 è stato trovato in tutte e tre le regioni polmonari ed è stato proiettato principalmente tra cardiomiociti vicini. Segnali correlati a Cx43 sono stati osservati sul lato polare e sul lato laterale dei cardiomiociti nelle maniche miocardiche.
