Per iniziare, scongelare la fiala criogenica del PBMC a bagnomaria a 37 gradi Celsius per due o tre minuti capovolgendola delicatamente. Quindi trasferire le celle scongelate in un tubo conico da 50 millilitri. Sciacquare la fiala criogenica con un millilitro di terreno di coltura completo caldo e aggiungere la soluzione goccia a goccia alle cellule nella provetta conica per eseguire la prima fase di diluizione.
Ora centrifugare la sospensione cellulare per cinque minuti e inclinare fluentemente la provetta conica per rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule in tre millilitri di terreno di coltura completo caldo. Per il conteggio delle cellule, mescolare 10 microlitri di sospensione cellulare con blu di tripano.
Contare le cellule utilizzando 10 microlitri di soluzione cellulare colorata, con un contatore di cellule automatizzato o una camera cellulare. Utilizzare un terreno di coltura completo caldo per diluire le cellule in modo da ottenere una concentrazione finale di una volta da 10 a sesta cellula per millilitro. Quindi seminare 100 microlitri di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti.
Aggiungere 100 microlitri delle due volte la diluizione del farmaco in ciascun pozzetto. Per raccogliere le cellule, centrifugare la piastra di coltura cellulare per 10 minuti. Utilizzare una pompa a vuoto per rimuovere il surnatante mentre si posiziona la punta della pompa nell'angolo inferiore del pozzetto per trattenere le cellule.
Ora aggiungi 200 microlitri di PBS ghiacciato a ciascun pozzetto. Dopo aver centrifugato la piastra per cinque minuti, rimuovere il surnatante. Quindi aggiungere 15 microlitri di tampone di lisi a ciascun pozzetto.
Utilizzando una pellicola sigillante adesiva, sigillare la piastra per proteggerla dalla contaminazione. Agitare la piastra e centrifugarla per un minuto. Infine, raccogliere sei microlitri della soluzione di cellule lisate in una piastra PCR.
